一種光聚合水凝膠局部藥物遞送系統及制備方法和應用與流程

本發明涉及生物高分子材料以及納米粒制劑技術領域，具體地說是一種光聚合水凝膠用于遞送抗腫瘤納米粒藥物的局部水凝膠藥物遞送系統及制備方法和用途。

技術背景

隨著經濟社會的飛速發展，人們正在越來越重視自身的健康問題，整個社會也把人的身心健康水平提升到更高的水平。然而，即使在科學技術如此發達的今天，依然有很多困擾科學界和醫學界的難題，癌癥就是其中一種。據CA Cancer J Clin公布的最新數據估計，2015年中國的癌癥總的發病病例數為429.16萬，總死亡病例數為281.42萬。由此可見，癌癥依然是威脅人們身心健康的巨大殺手。當前，治療癌癥的手段分為：化療、放療、手術治療。化療作為治療癌癥的一種主要的手段，被廣泛應用于臨床的腫瘤治療的過程中。諸多的化療藥物都是通過靜脈注射的方式進入全身循環從而達到腫瘤部位進而殺滅腫瘤細胞的。然而，這種全身性的給藥方式通常給患者帶來巨大的全身性毒副作用。患者表現出的適應性不好，易造成患者白血球減少、血小板減少、貧血、惡心、嘔吐等。而且嚴重的還會造成相關的并發癥，如心肌病變、肺間質纖維化、周圍神經病變、腎衰竭等。

為了減少化療藥物對于腫瘤患者的副作用，有越來越多的新劑型和載藥系統被研究和探討用于腫瘤患者化療的可能性。如：新型的納米粒制劑、脂質體制劑、新型的緩釋制劑等。此外還包括新開發的一些用于局部遞藥的水凝膠藥物遞送系統，也可以降低其全身毒副作用。水凝膠作為一種新型的生物醫用載體，在生物遞藥領域有著非常大的應用前景和巨大的潛力。它具備一些其他遞藥系統所不具備的性質，如：能夠在水中吸水溶脹而又不在水中溶解，具有多孔特性，能夠用于組織工程和生物降解等。當前，有越來越多的關于水凝膠作為藥物遞送系統的研究和報道，如：用Poly-(lactic-co-glycolic acid(PLGA)包裹的喜樹堿和長春新堿的納米顆粒被嵌入在光響應水凝膠內。并通過建立C6瘤腫瘤模型，觀察老鼠的生存率來評估效果。在另一項研究中,用PLGA泡沫體載紫杉醇。通過建立皮下腫瘤模型和相關的體外釋藥曲線評估體內的抗腫瘤效果。還有可調節的三嵌段共聚水凝膠被用于局部遞送三苯氧胺。緩慢釋放的紫杉醇納米粒不管是在體內還是在體外的實驗中都顯示了良好的抗腫瘤作用。但是大部分的水凝膠藥物遞送系統都存在一些問題，如：不易降解，成膠過程緩慢，生物相容性不好，載藥量不高，釋藥比較快，可操作性不強等。

低分子量透明質酸是人體內一種固有的成份，是一種葡聚糖醛酸，沒有種屬特異性，它廣泛存在于晶狀體、關節軟骨、皮膚真皮層等組織；在器官中分布在細胞質、細胞間質中，對其中所含的細胞和細胞器官本身起潤滑與滋養作用，同時提供細胞代謝的微環境。低分子量透明質酸作為一種內源性的物質，在體內易被透明質酸酶降解，生物相容性很好。另外由于透明質酸分子中含有比較多的羥基，可以跟水凝膠主鏈中的氧原子形成氫鍵，將透明質酸和水凝膠主鏈連接在一起，因此有越來越多的學者選擇透明質酸作為水凝膠材料。但是，大部分是以化學連接的形式。這樣并不能夠充分發揮透明質酸的優勢，而且，這樣的水凝膠降解速度比較緩慢，生物相容性的優勢并不突出。而且，透明質酸是一種性能非常優良的保水劑，有相關學者研究表明，透明質酸作為細胞基質的組成部分，其與CD44受體的聚集密切相關，其相關性與透明質酸的分子量有關。高分子量的透明質酸能夠促進CD44受體的聚集，而低分子量的透明質酸能夠明顯的抑制CD44受體的聚集。CD44受體在與腫瘤細胞的轉移和生長密切先關中發揮關鍵作用，因此，可以預見，低分子量的透明質酸能夠對于抑制腫瘤細胞的生長有一定的促進作用。現如今，有越來越多學者選擇透明質酸作為水凝膠材料，由于透明質酸分子中含有比較多的羥基，可以跟水凝膠主鏈中的氧原子形成氫鍵，將透明質酸和水凝膠主鏈連接在一起。但是，大部分是以化學連接的形式，這樣的水凝膠降解速度比較慢慢，生物相容性的優勢并不突出。因此，可以在水凝膠的形成過程中加入低分子量透明質酸，構建一種含有低分子量透明質酸的水凝膠。

技術實現要素：

本發明的目的在于克服水凝膠藥物遞送系統在體內的生物相容性不太好、控制藥物釋放問題和傳統DDS的毒副作用大的問題，提供一種光聚合水凝膠局部藥物遞送系統PEGDA-HA/PLGA-PTX，用于腫瘤的治療。將該藥物遞送系統埋植在腫瘤部位后，將充分發揮局部藥物遞送系統的優勢，伴隨著PEGDA-HA水凝膠的降解，會在腫瘤部位持續釋放足夠量的PTX，以達到殺死腫瘤細胞的目的。該藥物遞送系統將為腫瘤的局部化療提供一種可選方案。

實現本發明目的的具體方案是：

一種光聚合水凝膠局部藥物遞送系統，特點是該藥物遞送系統是通過將紫杉醇納米粒溶于過膜的PBS溶液，加入聚乙二醇二丙烯酸酯和低分子量透明質酸、光引發劑Irgacure2959形成水凝膠溶液，將該水凝膠溶液置于紫外光下照射形成的載藥水凝膠；其紫杉醇納米粒為PLGA包裹PTX的納米粒PLGA-PTX；在水凝膠溶液中，紫杉醇納米粒濃度為1mg/mL,PTX在紫杉醇納米粒PLGA-PTX中的含量為7-10％。

所述的低分子量透明質酸的分子量為776.64Da，聚乙二醇二丙烯酸酯的分子量為400Da；PLGA的分子量為38000-54000Da,lactide:glycolide＝50:50。

一種上述藥物遞送系統的制備方法，該方法包括以下具體步驟：

步驟1：制備紫杉醇PLGA-PTX納米粒

取PLGA和PTX粉末，質量比為10:1-15:1,溶于二氯甲烷作為有機相，濃度為10mg/mL-30mg/mL；再向有機相加入與二氯甲烷等量的質量比為1％的聚乙二醇水溶液作為水相，然后持續超聲，形成均一初乳；初乳水化，有機相揮發后，將溶液過G50水凝膠柱，離心操作，洗滌，得PLGA-PTX納米粒；

步驟2：制備光聚合水凝膠局部藥物遞送系統

取紫杉醇PLGA-PTX納米粒，溶解于過膜的pH＝7.0的PBS溶液中，得到納米粒溶液，其PTX濃度為1mg/mL；加入0.1g/mL-0.2g/mL的聚乙二醇二丙烯酸酯水凝膠單體；再加入5mg/mL-6.5mg/mL的低分子量透明質酸，攪拌均勻后，避光條件下，加入光引發劑Irgacure2959，得到水凝膠溶液；將水凝膠溶液置于能量密度為100-200mW/cm²的波長為300-400nm的紫外燈下，光照2-5min，形成了白色固體的載藥聚合水凝膠PEGDA-HA/PLGA-PTX即所述光聚合水凝膠局部藥物遞送系統；其中，所述光引發劑與聚乙二醇二丙烯酸酯的質量比為1:67-1:125。

所述的光聚合水凝膠局部藥物遞送系統在腫瘤的局部化療中的應用。

對本發明所述藥物遞送系統作以下測定：

測定PLGA-PTX納米粒的細胞毒性；

測定NCI-H460細胞對于PLGA-PTX納米粒的攝取；

測定載藥水凝膠PEGDA-HA/PLGA-PTX在體外的藥物釋放；

測定載藥水凝膠PEGDA-HA/PLGA-PTX對肺癌生長的抑制作用；

測定載藥水凝膠PEGDA-HA/PLGA-PTX作為局部水凝膠藥物遞送系統體內療效的H&E染色效果；

經測定表明，本發明的藥物遞送系統中低分子量透明質酸通過氫鍵與主鏈的聚乙二醇二丙烯酸酯相連接形成PEGDA-HA，然后通過加入光引發劑，在比較短的時間內光引發聚合形成了PEGDA-HA水凝膠。光聚合仿生水凝膠PEGDA-HA用于遞送PLGA-PTX納米粒。水凝膠系統中含有的PLGA-PTX納米粒一方面解決了PTX的水溶性問題，另一方面還能夠達到緩釋的效果。PEGDA-HA/PLGA-PTX藥物遞送系統能夠在腫瘤部位持續擴散并釋放，進而殺滅癌細胞。該系統由于加入了低分子量HA，因此有望提高溶脹率和載藥量，改善其降解性能和生物相容性；另外由于采用光聚合合成方法，其成膠過程迅速，可操作性強，有望用于原位光聚合成膠。將該藥物遞送系統直接作用于腫瘤部位，抑制腫瘤效果明顯，作用持久，可降解，生物相容性高。

本發明的藥物遞送系統，能夠主動靶向作用于腫瘤部位，可降解，并持續釋放藥物作用于腫瘤細胞，是一種毒副作用小，抗腫瘤效果突出的生物仿生水凝膠藥物遞送系統。

附圖說明

圖1為不同引發劑含量的PEGDA水凝膠的掃描電鏡圖；

圖2為不同引發劑含量的PEGDA水凝膠的化學降解圖；

圖3為不同低分子量透明質酸含量的PEGDA-HA水凝膠的溶脹曲線圖；

圖4為不同透明質酸含量的PEGDA-HA水凝膠的化學降解和酶降解曲線圖；

圖5為水凝膠過程圖；

圖6為水凝膠形態圖和SEM圖；

圖7為水凝膠過程¹H-HMR圖；

圖8為水凝膠的紅外譜圖；

圖9為PLGA-PTX納米粒的透射電鏡圖和粒徑分布、電位圖；

圖10為藥物遞送系統PEGDA-HA/PLGA-PTX的體外釋放曲線圖；

圖11為PLGA-PTX和游離PTX的CCK8曲線圖；

圖12為PLGA-PTX-DIO/PLGA-DIO納米粒的細胞攝取圖；

圖13為藥物遞送系統的抗腫瘤療效圖；

圖14為藥物遞送系統體內療效的H&E染色實驗圖。

具體實施方式

本發明藥物遞送系統由一種基于低分子量透明質酸的光聚合水凝膠PEGDA-HA載高分子藥物納米粒PLGA-PTX而構成，其制備過程如下：

步驟1：制備PLGA-PTX納米粒

取一定量的PLGA和PTX粉末溶于1mL二氯甲烷作為有機相，再向有機相加入等量的1％的聚乙二醇水溶液作為水相，然后持續超聲，形成均一初乳。初乳水化，有機相揮發。納米粒溶液過G50水凝膠柱，離心操作，洗滌。得納米粒；

步驟2:制備基于低分子量透明質酸的聚乙二醇二丙烯酸酯的光聚合水凝膠(PEGDA-HA)

包括引發劑2-羥基-4′-(2-羥乙氧基)-2-甲基苯丙酮與聚乙二醇二丙烯酸酯單體不同比例水凝膠的水凝膠時間及降解速率以及低分子量透明質酸與聚乙二醇二丙烯酸酯單體不同比例的溶脹率與分別在化學條件和生理條件的降解速率的關系。通過實驗確定了引發劑2-羥基-4-(2-羥乙氧基)-2-甲基苯丙酮與聚乙二醇二丙烯酸酯單體的比例關系以及低分子量透明質酸同聚乙二醇二丙烯酸酯單體的比例關系并制備了可降解的聚合物水凝膠；

步驟3：對應的紫杉醇濃度和聚乙二醇二丙烯酸酯單體的比例為1mg/g。所有的聚合物納米粒溶解在水凝膠溶液前均經過了G50的葡聚糖水凝膠柱的純化；

步驟4：引發劑2-羥基-4′-(2-羥乙氧基)-2-甲基苯丙酮與聚乙二醇二丙烯酸酯單體不同比例的水凝膠的掃描電鏡圖片(SEM)；

步驟5：引發劑2-羥基-4′-(2-羥乙氧基)-2-甲基苯丙酮與聚乙二醇二丙烯酸酯單體不同比例的水凝膠的溶脹率和水凝膠時間；

步驟6：低分子量透明質酸(HA)與聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)不同比例的水凝膠的溶脹率和降解速率；

步驟7：該水凝膠載藥系統所載的PLGA-PTX納米粒的透射電鏡形態以及DLS粒徑，zeta電位；

本發明的PLGA-PTX納米粒粒徑為170nm左右，zeta電位為-4.64mV，呈實心的球體。NCI-H460細胞對該納米粒有比較高的攝取率。

實施例1

(1)PLGA-PTX納米粒的制備

分析天平稱取10mg分子量為38000Da～54000Da的PLGA固體和1mgPTX固體于EP管中，向EP管中加入l mL二氯甲烷(AR)，待完全溶解，作為有機相。向有機相內加入等量的1mL 1％聚乙二醇水溶液(Mw＝2000Da)，持續超聲5min,得到均一的初乳。向初乳加入9mL的Mill-Q水，然后加入11mL的1％的聚乙二醇水溶液。室溫攪拌幾個小時，有機溶劑完全揮發。將納米粒溶液通過G50葡聚糖水凝膠柱純化。再將純化過后的PLGA-PTX納米粒于15000g離心，洗滌三次，除去過量的PVA溶液，收集離心管下層的納米粒，凍干。取一定量凍干得到的PLGA-PTX納米粒于5mL MeOH(HPLC級)中，室溫條件，59Hz超聲48h，離心，取上清液，通過HPLC測定紫杉醇含量，并根據所用紫杉醇測得的標準曲線，算出該納米粒載藥量為7.4％。色譜條件為：C18柱，柱溫40℃，流動相為水︰乙腈：甲醇＝41︰36︰23，紫外燈波長為227nm。

(2)PEGDA-HA水凝膠的制備

1)光引發劑與聚乙二醇二丙烯酸酯單體不同比例制備水凝膠的水凝膠時間、溶脹率和降解速率與引發劑含量的關系

分別稱取1g的PEGDA(Mw＝400)，加入五個不同的5mL的圓底燒瓶中，然后分別向燒瓶內加入5mL過膜的PBS溶液，機械攪拌，待溶液均勻后，避光條件分別加入0.05％w/w、0.5％w/w、1％w/w、2％w/w、4％w/w的2-羥基-4′-(2-羥乙氧基)-2-甲基苯丙酮光引發劑，避光環境，室溫條件攪拌2h。然后取出均勻的水凝膠液置于能量密度為166mW/cm²的波長為365nm的紫外燈下，觀察到水凝膠形成，精確記錄該過程的持續時間。每一組重復三次。由表1可見，隨著引發劑含量的增加，水凝膠時間逐漸縮短，后逐漸趨于平緩。將得到的不同引發劑含量的水凝膠凍干，得干水凝膠，稱重，記為初始值m0，然后將干水凝膠分別浸泡于10mL pH＝7.0過膜的PBS溶液中，浸泡24h，取出水凝膠，用吸水紙將水凝膠表面的水擦干，稱重，記為m1。每組重復測量三次。溶脹率＝(m1-m0)/m0×100％。由此得到不同引發劑單體比形成的水凝膠的溶脹率。由表1可見，水凝膠的溶脹率隨著引發劑含量的增加先增大后減小。通過圖1可見，隨著引發劑含量的增加，形成的水凝膠的孔徑逐漸縮小，其鎖水能力也在減小，溶脹率也會減小，特別是圖1的E圖，由于交聯密度過大，已經在掃描電鏡下觀察不到網孔的存在。將各個時間點的數據收集整理即得到了不同引發劑單體比的水凝膠的降解速率曲線。由圖2可見，A、B、C、D、E曲線顯示，隨著引發劑含量的增加，水凝膠的化學降解速率逐漸減慢，生物相容性依次遞減。

2)低分子量透明質酸同聚乙二醇二丙烯酸酯不同比例的水凝膠的溶脹率和降解速率同低分子量透明質酸含量的關系

分別稱取1g的PEGDA(Mw＝400)，加入五個不同的5mL的圓底燒瓶中，然后分別向燒瓶內加入5mL過膜的PBS溶液，機械攪拌，待溶液均勻后，避光條件分別加入1％w/w的2-羥基-4′-(2-羥乙氧基)-2-甲基苯丙酮光引發劑，然后分別加入低分子量透明質酸(Mw＝776.64)的量為5mg、10mg、25mg、50mg、100mg對應的濃度分別為1mg/mL、2mg/mL、5mg/mL、10mg/mL、20mg/mL，分別記為A，B，C，D，E。避光條件攪拌2h，得到均一的水凝膠溶液。然后將水凝膠溶液分別置于能量密度為166mW/cm2的波長為365nm的紫外燈下，光照2.5min，形成了白色的聚合水凝膠。分別將得到的不同引發劑單體比的水凝膠于37℃，50mL過膜的pH＝7.0的PBS溶液中，100r.min-1孵育，并于不同的時間點取出水凝膠，用吸水紙擦干水凝膠表面的水，稱重，記為m1，初始值為m0，降解率＝(m0-m1)/m0*100％。將各個時間點的降解率收集整理得到了不同低分子量透明質酸含量的水凝膠的化學降解速率曲線。見圖4(左)，結果顯示，隨著透明質酸含量的增加，水凝膠的化學降解速度逐漸增加，但是，200h后降解速度減慢。

分別將得到的不同引發劑單體比的干水凝膠于37℃，50mL過膜的pH＝7.0的PBS(含有10IU/mL的透明質酸酶)溶液中，100r.min^-1孵育，并于不同的時間點取出水凝膠，用吸水紙擦干水凝膠表面的水，稱重，與初始值比較計算降解率。將各個時間點的數據收集整理即得到了不同低分子量透明質酸單體比的水凝膠的酶降解速率曲線。見圖4(右)，結果顯示透明質酸含量越高，水凝膠的酶降解速度越快。原因在于透明質酸酶的存在可以加速含有低分子量透明質酸水凝膠的降解。酶降解速度明顯快于化學降解速度，為化學降解速度的兩倍。

將得到的不同低分子量透明質酸含量的水凝膠凍干，得干水凝膠，稱重，極為初始值m0，然后將干水凝膠分別浸泡于50mL過膜的pH＝7.0的PBS溶液中，浸泡24h，取出水凝膠，用吸水紙將水凝膠表面的水擦干，稱重，記為m1。每組重復測量三次。溶脹率＝(m1-m0)/m0×100％。得到不同低分子量透明質酸單體比的水凝膠的腫脹率曲線。見圖3，各組水凝膠溶脹率顯示，隨著低分子量透明質酸含量的增加，水凝膠的溶脹率逐漸增加，從最初的SR＝4增加到SR＝12，溶脹率變化很明顯。

(3)制備PEGDA-HA/PLGA-PTX水凝膠藥物遞送系統

分析天平稱取一定量的PLGA-PTX凍干納米粒，溶解于過膜的pH＝7.0的PBS溶液中，得到納米粒溶液，其對應的PTX濃度為1mg/mL。加入PEGDA，對應濃度為0.2g/mL。然后加入低分子量透明質酸(HA,Mw＝776.64)，透明質酸對應濃度為5mg/mL。攪拌均勻后，避光條件下，加入引發劑2-羥基-4′-(2-羥乙氧基)-2-甲基苯丙酮，對應濃度為1％w/w(引發劑/PEGDA單體)。將水凝膠溶液置于能量密度為166mW/cm2的波長為365nm的紫外燈下，光照2.5min，形成了白色的載藥聚合水凝膠PEGDA-HA/PLGA-PTX。由圖5可見，水凝膠形成過程非常迅速，在2.5min內由液態水凝膠液變成白色的固態水凝膠。形成的凝膠片如圖6(A)所示，圖6(B)為該凝膠片的凍干后的形態。圖6(C)和(D)是該凝膠的掃描電鏡圖，從中可以清楚地看到凝膠過程形成的凝膠網絡。

實施例2

稱取1g的PEGDA于5mL的燒瓶內，向其中加入5mL的D2O，攪拌均勻，然后加入25mg低分子量透明質酸HA，攪拌均勻。避光條件下，加入10mg的光引發劑Irgacure 2959，攪拌均勻。取50微升初始的水凝膠溶液于核磁管中，測試此時的¹H-NMR圖。然后將裝有水凝膠溶液的核磁管置于能量密度為166mW/cm²的波長為365nm的紫外燈下照射50s后觀察到，水凝膠開始以極快的速度形成，測試此時的1H-NMR圖。然后繼續在紫外燈下照射100s，觀察到水凝膠完全形成，測試此時的1H-NMR圖。由圖7可知，a1、b1、c1為t＝0的¹H-NMR圖，a2、b2、c2為t＝50s的¹H-NMR圖，a3、b3、c3為t＝150s的¹H-NMR圖，通過對比水凝膠過程不同時間點的水凝膠核磁氫譜，發現隨著水凝膠過程的進行，水凝膠的特征峰δ＝6.0～6.48有逐漸減弱的趨勢。其中δ＝6.0～6.48對應于PEGDA中的CH2＝CH-，進一步分析可知，隨著聚合反應的進行，體系中CH2＝CH-的比例逐漸減少。可從a1-a2-a3，b1-b2-b3，c1-c2-c3吸收峰的變化趨勢看出。

實施例3

取一定量的干水凝膠于石英研缽，取適量的KBr，研磨，壓片。于傅立葉紅外光譜儀中測得PEGDA-HA水凝膠的紅外光譜圖。由圖8分析可見，2900cm-1歸屬于PEGDA中-CH2-CH2-鏈節的C-H伸縮振動吸收峰。1720cm-1歸屬于PEGDA中酯鍵的C＝O伸縮振動吸收峰，1080cm-1為聚合物分子鏈的C-O伸縮振動的吸收峰，3409cm-1為水凝膠過程中未被取代的羥基的伸縮振動吸收峰。

實施例4

用Mill-Q水配置PLGA-PTX溶液，納米粒濃度為1mg/mL，超聲3min，靜置2min，用馬爾文激光粒度儀測定其粒徑大小、分布和納米粒表面的電性。測試結果顯示，納米粒粒徑為170nm左右，粒徑分布比較均一。zeta電位為-4.64mV。

實施例5

PLGA-PTX的形態通過透射電子顯微鏡(TEM)來觀察，需用1％的磷鎢酸負染制備樣品，具體如下：(1)滴一滴樣品溶液于銅網上，(2)空氣中干燥約10分鐘，用濾紙吸去多余的液體，(3)再滴一滴1％的磷鎢酸于銅網上，室溫干燥5分鐘后用濾紙吸去多余的染液，(4)待樣品干燥后置于透射電鏡下觀察。觀察到該PLGA-PTX納米粒呈現明顯的的核殼結構，呈球形。見圖9透射電鏡圖。

實施例6

PEGDA-HA/PLGA-PTX水凝膠藥物遞送系統體外釋藥特性：將實施例1中制備好的PEGDA-HA/PLGA-PTX水凝膠液和PEGDA-HA水凝膠液分別加入到黑色的96孔板中，每個孔加入200μL,其中PEGDA-HA水凝膠液作為空白對照。將裝有兩組水凝膠液的黑色96孔板置于能量密度為166mW/cm2的波長為365nm的紫外燈下，光照2.5min，形成了白色的載藥聚合水凝膠PEGDA-HA/PLGA-PTX和PEGDA-HA水凝膠。向每個有水凝膠的孔加入200μL的pH＝5.3的檸檬酸鹽緩沖液(包含10mg/mL的BSA)，然后將96孔板置于37℃，100r.min-1孵育。在每個特定的時間點t＝0，6h，24h，48h，72h，120h，168h，240h，312h取出100μL的緩釋樣品，然后加入100μL的甲醇，用于沉淀BSA。將處理后的樣品分別在15000g離心15min，收集上清液，通過HPLC測定PTX含量。色譜條件為：C18柱，柱溫40℃，流動相為水：乙腈：甲醇＝41：36：23，紫外燈波長為227nm。將測得的PEGDA-HA/PLGA-PTX組的PTX的量減去對照組的數據，再根據PTX溶解在甲醇中的標準曲線算出釋放的PTX的量。對比水凝膠載藥系統初始的PTX濃度，算出來分別在各個時間點PTX的釋放量。通過釋放曲線圖10可以看出，該水凝膠載藥系統在初始的24h內釋放量比較快有30％左右，而后釋放速度逐漸降低。直到釋放到第13天時，釋放了將近80％的藥量。可以預計，該水凝膠藥物遞送系統基本可以維持20天左右的藥物釋放。

實施例7

體外細胞攝取：以NCI-H460細胞為模型，將細胞以3×10⁵cells/ml的密度種于24孔板中培養24小時，然后用載有熒光染料PLGA-DIO和PLGA-PTX-DIO藥物時設置對照組。加藥處理后用PBS洗滌三次，分別用激光共聚焦定性和流式細胞儀定量評價細胞攝取情況。用激光共聚焦定性分析，細胞核用Hochest染成藍色。流式細胞儀分析的細胞先用PBS洗滌三次，用用PBS洗滌，消化、離心，將沉淀重懸，流式細胞儀檢測。如圖12所示，激光共聚焦結果定性觀察顯示，相比PLGA-DIO納米粒和PLGA-PTX-DIO納米粒細胞攝取差異不大而且攝取比例都相對較高。細胞儀定量考察也結果顯示，NCI-H460細胞對PLGA-DIO和PLGA-PTX-DIO納米粒子的攝取比例相對較高而且差異不大(P＜0.05)，分別為96.51％和96.24％。

實施例8

PLGA-PTX的細胞毒性評價：體外細胞毒性實驗以NCI-H460細胞為模型，采用CCK-8試劑盒分析IC50值來考察PLGA-PTX和游離的PTX對細胞的抑制率，具體方法：將密度為3*10⁵cells/mL的非小細胞肺癌細胞NCI-H460懸液種于96孔板中，放置在5％CO2條件下的37℃培養箱,培養24小時；向96孔板中加入不同濃度的PTX、PLGA-PTX兩種藥物溶液，并設置空白對照，和陰性對照(不加藥)，每組設三個復孔；加藥后將96孔板放置在5％CO₂條件下的37℃培養箱中繼續孵育48小時；移去孔中的液體，每孔再次加入100μl新鮮培養基和10μl CCK-8試劑；將96孔板放在37℃恒溫震蕩箱中輕微震蕩培養4小時；用酶標儀測定在450nm處的OD值。

細胞活性計算公式

細胞活性(％)＝[A(加藥)_OD-A(空白)_OD]/[A(不加藥)_OD-A(空白)_OD]×100％。

A(空白)：具有培養基和CCK-8溶液而沒有非小細胞肺癌細胞NCI-H460的孔的OD值；

A(加藥)：具有非小細胞肺癌細胞NCI-H460、CCK-8溶液和藥物溶液的孔的OD值；

A(不加藥)：具有非小細胞肺癌細胞NCI-H460、CCK-8溶液而沒有藥物溶液的孔的OD值。如圖所11示，PTX，PLGA-PTX處理NCI-H460細胞48h后，IC50值分別為10^-5.678mg/mL,10^-5.527mg/L。PLGA包裹的PTX納米粒IC50值與游離的PTX的IC50值比較接近，說明PLGA-PTX納米粒細胞毒性相近，而且間接反映出PLGA-PTX納米粒在48h內釋放的比較多。

實施例9

將NCI-H460細胞按常規條件(37℃，5％CO2)培養，待細胞融合度達到80-90％時，用含EDTA的0.25％胰酶消化細胞并離心收集，用pH＝7.4PBS洗滌細胞兩次計數，制備成終濃度為5×10⁶個/mL的單細胞懸液,用1mL注射器將細胞接種到裸鼠的右肩皮下,每只裸鼠接種0.1mL，當腫瘤長至400-500mm³時備用。當腫瘤長至400-500mm³時(記作0天),將荷瘤小鼠隨機分成4組,分別設為PBS對照組(尾靜脈注射100μL)(n＝6),PEGDA-HA組(植入腫瘤部位100μL)(n＝6)，PEGDA-HA/PLGA-PTX(5mg/kg)(植入腫瘤部位100μL)(n＝7)，PLGA-PTX組(尾靜脈注射PLGA-PTX納米粒100μL)(5mg/kg)(n＝6)，考察如下指標：

腫瘤生長曲線：每兩天用游標卡尺測量腫瘤的長徑和短徑,根據公式V＝1/2(長徑*短徑²)，算腫瘤的體積,繪制腫瘤體積隨時間變化的生長曲線。

體重變化曲線:每兩天稱量模型鼠的體重,繪制其體重隨時間的變化曲線，如果模型鼠體重降低不超過15％,可認為該載藥系統的毒性較小。

療效實驗結果如圖13所示，與PLGA-PTX(5mg/kg)組和PEGDA-HA/PLGA-PTX(5mg/kg)組相比，PEGDA-HA/PLGA-PTX(5mg/kg)表現出明顯的抑制腫瘤生長的效果。而且同對照組PBS組相比，PEGDA-HA組也有一定的效果。總體看來PEGDA-HA/PLGA-PTX自給藥開始20天內抑制腫瘤生長效果非常明顯。

實施例10

水凝膠載藥系統的作用于體內療效的H&E染色實驗：等到給藥到第20天左右的時間，處死組別分別為PBS組和PEGDA-HA/PLGA-PTX組各一只老鼠，分別取出老鼠的各個臟器和腫瘤組織，將臟器浸泡于福爾馬林溶液中，備用。制作各個臟器和腫瘤組織的石蠟切片。首先將石蠟切片梯度脫水，分別于二甲苯、二甲苯，100％乙醇，95％乙醇，80％乙醇，75％乙醇，水，梯度由高到低分別脫水10min，10min，5min，3min，3min；再從低濃度到高濃度脫一次，脫水完畢。脫水后首先用蘇木素染色15min，再用水洗3～4次，用1％的HCl乙醇溶液分化1～2s,然后用水洗3次。返藍3～4min，在水里搖一搖。伊紅染色1～3min，用梯度酒精迅速依次脫水2min(從高到低)。二甲苯透明5min x 2，最后用中性樹脂封片，封片過程中注意除去氣泡。運用熒光顯微鏡對H&E染色后的切片進行觀察，如圖14所示，其中A1、B1、C1、D1、E1、F1為PBS對照組，A2、B2、C2、D2、E2、F2為PEGDA-HA/PLGA-PTX實驗組。通過觀察發現，與PBS對照組相比，實驗組PEGDA-HA/PLGA-PTX組的腫瘤，在兩組腫瘤切片圖的相同位置觀察到，實驗組腫瘤細胞組織有明顯的壞死現象，而PBS對照組則沒有觀察到組織的壞死。對比其他臟器的切片圖，均沒有觀察到有組織壞死現象，說明該PEGDA-HA/PLGA-PTX水凝膠局部遞藥系統不會造成機體其他組織的壞死，符合課題設計預期。

表1.不同引發劑含量的PEGDA水凝膠的水凝膠時間和溶脹率(每個樣品均重復測量三次取平均值)

a:Irgacure2959

b:PEGDA。