一種光敏生物膠及其制備方法
【專利摘要】本發明提供了一種光敏生物膠，以豬小腸粘膜脫細胞基質作為支架材料，含有核黃素或其衍生物。本發明制得的凝膠與人細胞外基質成分高度接近，含有豐富的生長因子，具有良好的生物相容性，更有利于支持細胞的生長。本發明制作工藝簡單，除原材料外，僅需白熾燈作為生產設備，不需要復雜的設備，整個操作過程不含有對細胞有害的成分，且不造成環境污染。
【專利說明】
_種光敏生物膠及其制備方法
技術領域
[0001 ]本發明涉及一種生物材料，具體涉及一種光敏材料及其制備方法。
【背景技術】
[0002] 創面修復是臨床面臨的一個重要課題，特別是因糖尿病引起的慢性創面的修復， 一直未能得到很好的解決。創面的修復是細胞和細胞外基質相互作用的結果，細胞外基質 為細胞的良好生長提供條件。在慢性創面的局部，其細胞外基質發生病理變化，已不適于細 胞的生長，這也是其長期不愈，反復發作的一個重要原因。此時，為其補充正常的細胞外基 質，將有利于促進其創面的愈合。
[0003] 豬小腸粘膜脫細胞基質（small intestinal submucosa，SIS)作為天然的細胞外 基質成分，其所含的物質化學成分與人細胞外基質成分高度接近，具有良好的生物相容性， 廣泛應用于臨床各種組織的修復支架。但應用于糖尿病潰瘍等不規則的創面，不能與創面 完全貼合，影響愈合效果。為解決這一問題，通常是將膠原等細胞外基質主要成分進行化學 改性，引入雙鍵基團，再加入Irgacure2959等光敏試劑，在特殊波段的光照下形成凝膠。
[0004] 上述方法雖能在原位形成凝膠，解決外源細胞外基質與創面無縫結合的問題，但 存在以下問題：1)需要對膠原等細胞外基質成分進行改性，程序復雜，不可避免的引起改性 物質的殘留，且純化過后終產品的得率低下；2)常用的光敏劑Irgacure 2959有一定的細胞 毒性;3)需要使用特殊波段的光源，使用的便捷性不夠。
【發明內容】
[0005] 本發明目的在于提供一種能夠在創面上原位成膠并對創面無任何損傷的可吸收 生物凝膠;并提供一種簡便有效的光敏細胞外基質材料的制備方法。
[0006] 一種光敏生物膠，以豬小腸粘膜脫細胞基質（small intestinal submucosa，SIS) 作為支架材料，含有核黃素(維生素 B2)或其衍生物。
[0007] 本發明以豬小腸粘膜基質為原材料，以核黃素或其衍生物為交聯劑，通過可見光 交聯誘發，增強分散度很高的基團間鍵能，有效的將溶液相變為固體凝膠，并保持良好組織 相容性和生物活性。
[0008] 本發明可在創面原位成膠無任何創傷，同時能最大程度的保留SIS中的多種細胞 因子，并具有生物活性，有利于組織重塑和傷口修復。
[0009] 上述的光敏生物膠，核黃素或其衍生物:豬小腸粘膜脫細胞基質質量百分比優選 為1-4:10-40。
[0010] 上述光敏生物膠的制備方法，將核黃素或其衍生物加入豬小腸粘膜脫細胞基質， 白熾燈照射3-5min。
[0011]上述光敏生物膠的制備方法，包括以下步驟:將豬SIS溶解于中性溶液后，加入核 黃素或其衍生物混合，使用普通白熾燈光源照射3_5min形成凝膠。本發明方便簡單易操作， 無需額外的化學修飾，且形成的凝膠生物相容性好，細胞可在其表面生長。
[0012] 上述光敏生物膠的制備方法，包括以下步驟：
[0013] USIS原料準備：
[0014] (1)將0.5 % -2 %的豬小腸粘膜基質（SIS)溶解于0.0 lM鹽酸或醋酸，溶解后與1/10 體積的〇. IM NaOH混合，調pH值至中性；
[00?5] ⑵配制I OOmg/ml的核黃素原液；
[0016] (3)將核黃素與中性SIS混合均勻，核黃素終濃度為0.05%-0.2% ;
[0017] 2、光敏成膠
[0018]將混合溶液滴入96孔板或其他模具中，用200W的白熾燈泡距離96孔板或模具10-30cm處照射3-5min，溶液即發生相變，形成凝膠。
[0019] 有益效果
[0020] (1)本發明制得的凝膠與人細胞外基質成分高度接近，含有豐富的生長因子，具有 良好的生物相容性，更有利于支持細胞的生長。
[0021] (2)本發明制作工藝簡單，除原材料外，僅需白熾燈作為生產設備，不需要復雜的 設備，整個操作過程不含有對細胞有害的成分，且不造成環境污染。
[0022] (3)本發明可用作細胞治療的載體，原位形成帶細胞的凝膠進行組織再生修復。本 發明還可用與3D打印相結合，制備不同形狀和含不同類型細胞及不同結構的復雜3D組織工 程產品。
【附圖說明】
[0023]圖1光敏凝膠；
[0024] 圖2光敏組織材料中細胞存活和生長情況;A-體外培養1天后細胞染色情況，B-體 外培養3天后細胞染色情況。
[0025] 圖3光敏凝膠用于動物創傷原位修復;左側為對照組，右側為實驗組。
【具體實施方式】
[0026] 下面結合實施例對本發明的【具體實施方式】做進一步的描述，并不因此將本發明限 制在所述的實施例范圍之中。
[0027] 實施例1
[0028] -種光敏生物膠，其制備方法包括以下步驟：
[0029] 1、原料準備：
[0030] 1)將〇.5%-2%的豬小腸粘膜基質（SIS)溶解于0.OlM鹽酸或醋酸，徹底溶解后與 1/10體積的〇. IM NaOH混合，調pH值至中性。
[0031] 2)配制100mg/ml的核黃素原液備用。
[0032] 3)將核黃素與中性SIS混合均勻，核黃素終濃度為0.05%-0.2%。
[0033] 2、光敏成膠
[0034]將混合的溶液滴入96孔板或其他模具中，用200W的白熾燈泡距離96孔板或模具 10-30cm處照射3-5min，溶液即發生相變，形成凝膠，其大體形態如圖1所示。
[0035] 3、光敏凝膠的細胞相容性評價
[0036]將小鼠骨髓干細胞以10000/cm2的密度接種于光敏膠的表面，培養1天和3天后分 別進行活死細胞染色分析(活-死細胞染色試劑盒，Invitrogen)，結果如圖2所示，可見本凝 膠具有良好的細胞相容性。
[0037]圖2-A中，培養1天后活細胞為綠色，死細胞為紅色。在圖中可以看到，細胞成功的 長在水凝膠上，并且沒有任何死細胞，細胞生長良好。這證明光引發的SIS水凝膠對細胞無 任何毒副作用，有良好的細胞相容性。
[0038]圖2-B中，培養3天后，與培養一天的照片相比，細胞數量增多，這說明細胞已經開 始繁衍，而且擴散均勻，并無任何死細胞。這表現SIS光引發的水凝膠不僅生物相容性良好， 并且能促進和支撐細胞生殖繁衍，能夠錨定細胞，是良好的生物材料支架。
[0039] 4.光敏凝膠中的細胞因子檢測
[0040]采用ELISA檢測分別原材料豬小腸粘膜基質SIS以及光敏凝膠中細胞因子VEGF，b-FGF，TGF-b，and TNF-a含量如表 1 所示。
[0041]衷1 L 〇〇43 J 5.植入動物體后原位修復買驗
[0044] (l)200mgSis粉末，溶解于0.01M HCL IOml中（濃度2%)，用小磁力攪拌子，4攝氏 度溶解48h，中途用棒攪拌一次把上層的sis充分溶解至溶液中，無大顆粒，均質。
[0045] (2)核黃素 IOOmg溶解于10*PBSlml中（濃度10%)，用2ml EP管操作，錫箱紙包裹避 光。
[0046] (3)調節sis溶液至中性：取IOOulO. IM NaOH溶液加入2ml EP管，取Iml溶解好的 sis溶液Iml加入此EP管，輕輕吹打一下，再取IlOul 10*PBS直接加入此溶液中，再次輕輕吹 打。由于材料粘稠度高，吸頭操作很容易產生氣泡，吹打時移液槍按下一半即可，避免產生 大量氣泡。
[0047] (4)取配置好的20uI 10 %濃度核黃素，直接加入到上述調節至中性的sis溶液中。 備注:加核黃素時，槍頭從EP管底部由下至上一點點加入，以達到均勻的效果，此時核黃素 終濃度為0.2%。
[0048] (5)小鼠麻醉，背部脫毛，用punch在小鼠背部制作一個直徑6mm的皮膚缺損
[0049] (6)取加入核黃素的sis溶液0.1ml滴在小鼠皮膚缺損處，，用200w白熾燈距創面 20cm處照射6min，即可成膠，結果如圖3所示，左側為未做任何處理的創傷對照組，右側為創 面直接成膠的實驗組。
【主權項】
1. 一種光敏生物膠，以豬小腸粘膜脫細胞基質作為支架材料，其特征在于:含有核黃素 或其衍生物。2. 如權利要求1所述的光敏生物膠，核黃素或其衍生物:豬小腸粘膜脫細胞基質質量百 分比為 1-4:10-40。3. 如權利要求1或2所述光敏生物膠的制備方法，將核黃素或其衍生物加入豬小腸粘膜 脫細胞基質，白熾燈照射3_5min。4. 如權利要求3所述光敏生物膠的制備方法，包括以下步驟:將豬SIS溶解于中性溶液 后，加入核黃素或其衍生物混合，使用普通白熾燈光源照射3-5min形成凝膠。5. 如權利要求3所述光敏生物膠的制備方法，包括以下步驟： (1)將0.5%-2%的豬小腸粘膜基質溶解于0.01M鹽酸或醋酸，溶解后與1/10體積的0.1M NaOH混合，調pH值至中性； (2 )配制100mg/ml的核黃素原液； (3) 將核黃素與中性SIS混合均勻，核黃素終濃度為0.05%-0.2%; (4) 將混合溶液滴入模具中，用200W白熾燈泡距離模具10-30cm處照射3-5min，溶液即 發生相變，形成凝膠。
【文檔編號】A61K47/46GK105963770SQ201610301638
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2016年5月9日
【發明人】曹川 , 朱寧文, 徐金華, 李世榮, 葛良鵬, 劉弓伯, 廖建貴, 姜俊姿, 王量, 劉建蘭, 周靜, 葉小璐
【申請人】中國人民解放軍第三軍醫大學, 復旦大學附屬華山醫院