一株耐銅的醋酸鈣不動桿菌kw3及其在銅礦廢水處理中的應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于環境生物技術領域，具體涉及一株耐銅的醋酸鈣不動桿菌KW3及其在 銅礦廢水處理中的應用。
【背景技術】
[0002] 銅礦廢水主要來自于銅采礦和選礦工藝，具有排放量大、排放持續性強、污染物種 類多、危害大、不易控制等特點，是一種非常難處理的廢水。根據《銅、鎳、鈷工業污染物排 放標準》（GB 25467-2010)中規定，自2011年起，現有企業水污染物中總銅排放量需低于 1.0 mg/L，新建企業水污染物中總銅排放量需低于0. 5mg/L。但是，目前銅礦廢水中所含重金 屬離子大大超過工業廢水排放標準，在外排過程中，如果不加以處理，隨意排放，將會嚴重 污染地表水和地下水，對周邊生態環境產生毀滅性的后果。
[0003] 銅礦廢水中含有大量重金屬離子，且含金屬離子的銅礦廢水呈硫酸型，一般pH值 多在2. 5~6. 0之間，對污水處理系統污泥里的微生物具有強烈的抑制作用，使得微生物無 法正常生長。目前還未有可以耐高濃度銅離子的醋酸鈣不動桿菌及其在銅礦廢水處理中的 應用的相關報道。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的在于提供一株耐銅的醋酸鈣不動桿菌KW3及其在銅礦廢水處理中 的應用。
[0005] 為實現上述發明目的，本發明所采用的技術方案為：
[0006] 一株耐銅的醋酸鈣不動桿菌，其特征在于，該菌株命名為醋酸鈣不動桿菌KW3,已 于2015年6月16日保藏于中國典型培養物保藏中心（武漢大學保藏中心），保藏單位地 址：中國武漢武漢大學，其保藏號為CCTCC NO :M 2015376。
[0007] 上述醋酸鈣不動桿菌KW3的菌落形態為：菌落呈淺黃色，菌落直徑0. 5~1mm，形 狀不規則，邊緣光滑整齊，有光澤，易挑取；菌體為球桿狀，革蘭氏陰性菌，嚴格需氧；最適 基本培養基為牛肉膏蛋白胨培養基，最佳pH是6. 5,最適生長溫度為32~37°C，最佳滲透 壓（NaCl% )濃度為1. 3%。
[0008] 上述醋酸鈣不動桿菌KW3的16S rDNA基因序列特征為：16S rDNA基因序列長度 為1425bp，采用BLAST分析法將16S rDNA序列與GenBank數據庫進行比對分析，發現該菌 株與醋酸鈣不動桿菌的親緣關系最接近，同源性高達99%以上。
[0009] -株醋酸鈣不動桿菌KW3在銅礦廢水處理中的應用。
[0010] 上述方案中，所述應用的方法為：將醋酸鈣不動桿菌KW3菌液與銅礦廢水按照體 積比為1:20~1:10的比例混合，調節混合液的pH為5~8,將混合液置于25~37°C條件 下恒溫培養72h。
[0011] 上述方案中，所述醋酸鈣不動桿菌KW3菌液通過如下方法獲得：將醋酸鈣不動 桿菌KW3接種至牛肉膏蛋白胨液體培養基中，于32~37°C、120~140r/min條件下培養 24h ~48h 至菌體濃度達到 2. OX IO9~L OX 10 lclcfu/mL。
[0012] 上述方案中，所述牛肉膏蛋白胨液體培養基為：牛肉膏5. 0g，蛋白胨10. 0g，NaCl 5. 0g，蒸餾水定容至1000mL，調pH 7. 0。
[0013] 本發明的有益效果如下：本發明所述醋酸鈣不動桿菌KW3在高濃度酸性銅礦廢水 中具有較好的適應能力和去除廢水中銅離子的能力，該菌株在72h之內對銅礦廢水中的銅 離子的去除效率達到67. 4%~80. 3%;本發明為處理高濃度酸性銅礦廢水提供了有用的菌 源，拓寬了對醋酸鈣不動桿菌的應用，具有較強的應用價值。
【附圖說明】
[0014] 圖1為醋酸鈣不動桿菌KW3的PCR產物瓊脂糖電泳圖，其中左為擴增產物，右為 Marker，Marker 條帶從上至下分別為：2000,1000, 750, 500, 250,100bp。
[0015] 圖2為基于16S rDNA序列的醋酸鈣不動桿菌KW3的系統發育樹。
【具體實施方式】
[0016] 為了更好地理解本發明，下面結合實施例進一步闡明本發明的內容，但本發明的 內容不僅僅局限于下面的實施例。
[0017] 實施例1 :菌株的分離、篩選和鑒定
[0018] ( -）材料準備：
[0019] 1.實驗廢水和污泥取自湖北省大冶銅綠山銅鐵礦洗礦池。
[0020] 2.培養基
[0021] 分離培養基：牛肉膏5. 0g，蛋白胨10. 0g，NaCl 5. 0g，硫酸銅0. lg，瓊脂15g，蒸餾 水定容至 lOOOmL，pH 7. 0。
[0022] 篩選培養基：牛肉膏5. 0g，蛋白胨10. 0g，NaCl 5. 0g，瓊脂15g，硫酸銅0. 1~ 1.0 g (以0.1 g為單位遞增），蒸餾水定容至1000mL，pH 6. 5。
[0023] 馴化培養基：牛肉膏5. 0g，蛋白胨10. 0g，NaCl 5. 0g，硫酸銅0. 5g，蒸餾水定容至 1000 mL? pH 6. 5〇
[0024] 牛肉膏蛋白胨固體培養基：牛肉膏5. 0g，蛋白胨10.0g，NaCl 5.0g，瓊脂15g，蒸餾 水定容至 lOOOmL，pH 7. 0。
[0025] 牛肉膏蛋白胨液體培養基：牛肉膏5. 0g，蛋白胨10. 0g，NaCl 5. 0g，蒸餾水定容至 1000mL? pH 7. 0〇
[0026] 3.實驗儀器和設備：
[0027] 高壓蒸汽滅菌鍋（LS-B75L-I)，超凈工作臺（SW-CJ-2F)，恒溫振蕩培養箱 (BS-IE)，生化培養箱（LRH-70F)，pH計（PHS-3C)，PCR儀（A300)，電泳儀及電泳槽 (Bio-Rad)，凝膠成像系統（GIAS-4400)，光學顯微鏡（BK3000)，原子吸收分光光度計 (AA-240FS)〇
[0028] (二）菌株的分離篩選與馴化：
[0029] 1.稱取Ig取自湖北省大冶銅綠山銅鐵礦洗礦池底泥樣品，加入到裝有IOOmL無菌 水的250mL錐形瓶中，置恒溫搖床110r/min，30°C振蕩15分鐘，得泥水混合液A ;
[0030] 2.取IOmL泥水混合液A，轉入含有IOOmL分離培養基的500mL錐形瓶中，恒溫搖 床110r/min，30°C振蕩培養24h，得菌懸液B ;
[0031] 3.取ImL菌懸液B涂布接種于分離培養基上，37°C恒溫培養3天，挑取在菌落特征 上有明顯差異的單菌落，反復劃線接種于分離培養基上，重復操作5次，直至得到純化的菌 株；
[0032] 4.將純化的菌株反復劃線接種于篩選培養基上，篩選培養基中硫酸銅濃度由低到 高遞增，37°C恒溫培養，得到在篩選培養基上生長狀況最好，耐受硫酸銅濃度最高的一株菌 株，將其命名為醋酸鈣不動桿菌菌株KW3 ;
[0033] 5.挑取篩選出的醋酸鈣不動桿菌菌株KW3單菌落，反復接種于馴化培養基，37°C 恒溫培養，直至醋酸鈣不動桿菌菌株KW3在馴化培養基內能穩定快速生長。
[0034] (三）菌株特性及鑒定
[0035] 醋酸鈣不動桿菌菌株KW3的菌落形態為：菌落呈淺黃色，菌落直徑0. 5~1mm，形 狀不規則，邊緣光滑整齊，有光澤，易挑取；菌體為球桿狀，革蘭氏陰性菌，嚴格需氧；最適 基本培養基為牛肉膏蛋白胨培養基，最佳pH是6. 5,最適生長溫度為32~37°C，最佳滲透 壓（NaCl% )濃度為1. 3%。
[0036] 醋酸鈣不動桿菌菌株KW3的16S rDNA基因序列長度為1430bp，其PCR產物瓊脂糖 電泳圖見圖1，采用BLAST分析法將醋酸鈣不動桿菌KW3的16S rDNA序列與GenBank數據 庫進行比對分析，發現醋酸鈣不動桿菌KW3與醋酸鈣不動桿菌的親緣關系最接近，同源性 高達99%以上。采用MEGA程序對該菌進行了系統發育進化分析，并繪制系統發育樹，如圖 2所示。
[0037] 該菌株已于2015年6月16日保藏于中國典型培養物保藏中心（武漢大學保藏中 心），保藏單位地址：中國武漢武漢大學，分類命名為：Acinetobacter calcoaceticus KW3， 保藏號為CCTCC NO :M 2015376。本發明篩選出了一株具有較強的銅吸附能力的醋酸鈣不 動桿菌，目前尚無醋酸鈣不動桿菌用于銅礦廢水處理的報道，這拓寬了人們對醋酸鈣不動 桿菌的應用研宄，為處理高濃度酸性銅礦廢水提供了有用的菌源和技術，具有較強的應用 價值。
[0038] 實施例2 :醋酸鈣不動桿菌KW3在銅礦廢水處理中的應用
[0039] 醋酸鈣不動桿菌KW3在銅礦廢水處理中的應用，具體的應用方法包括如下步驟： (1)醋酸鈣不動桿菌KW3菌液的獲得：將醋酸鈣不動桿菌KW3接種至牛肉膏蛋白胨液體培 養基中，于32~37°〇、120~1601'/111丨11條件下培養2411~4811至菌體濃度為2.0\109~ 1.0\10 1(1(^11/1^;所述牛肉膏蛋白胨液體培養基為：牛肉膏5.(^，蛋白胨10.(^，似(：1 5. 0g，蒸餾水定容至1000ml，調pH 7. 0 ; (2)將醋酸鈣不動桿菌KW3菌液與銅礦廢水按照體 積比為1:20~1:10的比例混合，調節混合液的pH為5~8,將混合液置于25~37°C條件 下恒溫培養72h。
[0040] 具體地，取ImL菌體濃度為2. OX IO9CfVmL的醋酸鈣不動桿菌KW3菌液接種于 IOmL銅礦廢水中（初始銅濃度約為162.2mg/L，pH 3.18)，調節？!1為5，置于37°0、15〇1·/ min振蕩培養72h，計算菌株對廢水中銅的去除率。結果表明：該菌株能在72h內去除銅礦 廢水中的銅130. 25mg/L，去除率達到80. 3%。
[0041] 具體地，取ImL菌體濃度為1.0 X 101(lCfu/mL的醋酸鈣不動桿菌KW3菌液接種于 20mL銅礦廢水中（初始銅濃度約為162.2mg/L，pH 3.18)，調節pH為8,置于25°C、150r/ min振蕩培養72h，計算菌株對廢水中銅的去除率。結果表明：該菌株能在72h內去除銅礦 廢水中的銅109. 32mg/L，去除率達到67. 4%。
[0042] 顯然，上述實施例僅僅是為清楚地說明所作的實例，而并非對實施方式的限制。對 于所屬領域的普通技術人員來說，在上述說明的基礎上還可以做出其它不同形式的變化或 變動。這里無需也無法對所有的實施方式予以窮舉。而因此所引申的顯而易見的變化或變 動仍處于本發明創造的保護范圍之內。
【主權項】
1. 一株耐銅的醋酸鈣不動桿菌，其特征在于，該菌株命名為醋酸鈣不動桿菌KW3,保藏 于中國典型培養物保藏中心，保藏號為CCTCC NO :M 2015376。2. 權利要求1所述耐銅的醋酸鈣不動桿菌在銅礦廢水處理中的應用。3. 根據權利要求2所述的應用，其特征在于，所述應用的具體方法為：將醋酸鈣不動桿 菌KW3菌液與銅礦廢水按照體積比為1:20~1:10的比例混合，調節混合液的pH為5~8， 將混合液置于25~37°C條件下恒溫培養72h。4. 根據權利要求3所述的應用，其特征在于，所述醋酸鈣不動桿菌KW3菌液通過如 下方法獲得：將醋酸鈣不動桿菌KW3接種至牛肉膏蛋白胨液體培養基中，于32~37°C、 120~140r/min 條件下培養 24h~48h 至菌體濃度為 2. OX 109~1. OX 101(lcfu/mL。5. 根據權利要求4所述的應用，其特征在于，所述牛肉膏蛋白胨液體培養基為：牛肉膏 5.0 g，蛋白胨 10.0 g，NaCl 5.0 g，蒸餾水定容至 1000 mL，調 pH 7.0。
【專利摘要】本發明屬于環境生物技術領域，具體涉及一株耐銅的醋酸鈣不動桿菌KW3及其在銅礦廢水處理中的應用。本發明提供的醋酸鈣不動桿菌KW3已于2015年6月16日保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏號為CCTCC NO：M 2015376。本發明所述醋酸鈣不動桿菌KW3在高濃度酸性銅礦廢水中具有較好的適應能力和去除廢水中銅離子的能力，該菌株在72h之內對銅礦廢水中的銅離子的去除效率達到67.4％～80.3％；本發明為處理高濃度酸性銅礦廢水提供了有用的菌源，拓寬了對醋酸鈣不動桿菌的應用，具有較強的應用價值。CCTCC NO：M 201537620150616
【IPC分類】C02F3/34, C12N1/20, C12R1/01, C02F103/10
【公開號】CN104946570
【申請號】CN201510399023
【發明人】康薇, 鄭進
【申請人】湖北理工學院
【公開日】2015年9月30日
【申請日】2015年7月8日