一種石油降解菌協同降解采油廢水的方法
【專利摘要】一種石油降解菌協同降解采油廢水的方法，步驟如下：（1）將純化的單一的銅綠假單胞菌、枯草桿菌、門多薩假單胞菌和鮑氏不動桿菌菌株接種到牛肉膏蛋白胨培養基中，培養18h，得到種子菌液；（2）制備種子菌液的馴化培養液；（3）將制備的馴化培養液按單株菌液等體積比加入發酵培養基中，培養；（4）將發酵菌液投入曝氣池中進行采油廢水的處理。復合高效除油菌株可對采油廢水中的烴類化合物降解率在94%以上；選用的菌種不僅各自高效的原油降解率，菌種之間還能起到協同作用，幾種細菌共同對原油進行降解效率遠大于單獨作用簡單疊加的效果。
【專利說明】一種石油降解菌協同降解采油廢水的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及污水處理【技術領域】，尤其是涉及一種除油菌協同降解采油廢水的方法。
【背景技術】
[0002]在油田開發初期，通常情況下鉆出油井后，原始地層能量如天然水驅、彈性能量驅、溶解氣驅及重力驅等可將地層原油通過油流通道舉升至地面，這種以自噴開采石油的方式，稱為一次采油。一次采油采出液的含水率很低，約5~10%左右。一次采油造成原始地層能量迅速遞減，靠原始地層能量開采原油的方式難以維持，這時需要向地底油層注水或注氣以補充能量，來實施二次采油。全國大部分油井都采用注水開發的方式進行二次采油。而開發稠油油田則需要將高壓水蒸汽從油井注入地層，待注入的高壓水蒸氣將稠油減粘后，水蒸氣的冷凝水為油層提供能量，油水混合的采出液被一起從油井采出。隨著油田開發時期的延長，注水或注氣的二次采油方式使采出原油含水率不斷上升。華東地區各油田的采出液含水率已經超過了 85%。近些年來，我國大部分油田相繼進入了采用聚合物驅和三元復合驅的三次采油階段，該技術大面積應用于大慶油田和勝利油田。與一般油田采油廢水相比，三次采油廢水具有以下特點:三次采油廢水中除了含有大量石油類有機物、懸浮固體顆粒、溶解性礦物質和微生物等常規污染物之外，還含有大量的堿、表面活性劑和高分子水解聚丙烯酰胺(HPAM)等驅油劑，因此三次采油廢水COD高、黏度大、乳化程度高、有機污染物穩定性增強、可生物降解性降低。
[0003]隨著油藏開采時期的延長和采油工藝技術的不斷創新，淮安金南油田已進入三次采油階段，出現了注水量大、采出液量大、采油廢水量大、能量資源消耗高的“三大一高”現象。采油廢水高達90%以上。廢水粘度大，乳化油穩定，另含有溶解性礦物質、酚類化合物、細菌、懸浮固體雜質以及所投加的破乳劑、清蠟劑和降粘劑等采油助劑，具有有機成分復雜且難去除，懸浮物較多且粒徑小的特點。采油廢水處理后回注，不僅可以減少采油廢水外排帶來的嚴重的環境污染，極大地提高水資源的利用率，而且可以保護金南油田地下油層能量，維持油層壓力并提高采油效率。但是回注水水質不合格，特別是回注水中的含油量、固體懸浮物及硫酸鹽還原菌(SRB菌)超標，將會堵塞地層滲流孔道，腐蝕生產設施，嚴重危害注水開采油田。油田回注水處理技術的關鍵是去除采油廢水中的油、細菌和懸浮物。以往處理含油廢水主要采用的物理處理和化學方法均存在不足之處，物理法除油效果差且耗時長，化學法消耗大量混凝劑且產生二次污染。微生物法處理含油廢水能夠避免二次污染，凈化效果好，且處理費用低廉，因而被越來越廣泛的運用。能夠篩選出高效降解石油菌對于油田廢水的治理具有重大的意義并會帶來巨大的社會效益，但是現有微生物法處理含油廢水效率較低，廢水處理時間較長。
【發明內容】
[0004]本發明要解決的技術問題是:為了克服現有技術中微生物法處理含油廢水效率較低、處理時間較長的不足，提供一種除油菌協同降解采油廢水的方法。
[0005]本發明解決其技術問題所采用的技術方案是:
[0006]一種石油降解菌協同降解采油廢水的方法，包括如下步驟:
[0007](I)將純化的單一的銅綠假單胞菌、枯草桿菌、門多薩假單胞菌和鮑氏不動桿菌菌株接種到牛肉膏蛋白胨培養基中，pH7.5、35°C、200r/min搖床培養18h，得到種子菌液；
[0008](2)制備種子菌液的馴化培養液；
[0009](3)將步驟(2)制備的馴化培養液按單株菌液等體積比加入發酵培養基中，在pH7.5、35°C、250r/min條件下，培養24~48h，使發酵菌液細胞濃度≥109CFU/mL ；
[0010](4)將發酵菌液投入曝氣池中進行采油廢水的處理。
[0011]進一步地，步驟(2)所述的馴化培養液制備方法如下:
[0012]取種子菌液加入含有原油樣品的培養基，pH7.5、33°C、150r/min搖床培養2d，培養基中原油樣品體積含量為1.5%，接種至新鮮的含有原油樣品的培養基中；重復上述步驟4次，每一次轉接的培養基內原有樣品體積含量都以5%。的速度遞增，8天后得到馴化培養液。
[0013]作為優選，所述的培養基為組成及重量份數為:KH2P040.85份、K2HPO4L 55份、MgSO4.H2O0.5 份、CaCl20. 1 份、NH4Cll.5 份、MnSO4.H2O0.5 份、FeSO4.H2O0.005 份、NH4SO40.1份、H3BO30.01份、去離子水1000份；
[0014]所述的原油樣品為120#溶劑油與渣油以質量比為1:3的混合物。
[0015]作為優選，步驟(2)所述的馴化培養液制備方法如下:
[0016]取原油采出液，向其中加入對應無碳基礎鹽培養基和種子菌液，原油采出液與無碳基礎鹽培養基體積比為1:5，pH7.5、33°C、150r/min搖床培養2d ;取步驟上述培養得到的培養液接種至相同的新鮮原油采出液和培養基內，于相同條件下培養2d，如此連續富集培養四次，Sd后得到馴化培養液。
[0017]進一步地，所述的無碳基礎鹽培養基組份及重量份數為:KH2P0448.28份、K2HP0450.10 份、MgSO4.7Η2013.41 份、CaCl2L 20 份、ΚΝ0375.75 份、FeSO4.7Η2015.15 份、Na2EDTA3.72 份、MnSO4.H2Ol.69 份、H3BO3L 22 份和去離子水 1000 份。
[0018]作為優選，步驟(3)中所述的馴化菌液體積為發酵培養基體積的2.5% ;所述的發酵培養基組分及重量份數為:水解植物蛋白粉WA — 310份、牛肉膏5份、NaC15份、去離子水1000 份。
[0019]作為優選，步驟(4)中所述的發酵菌液體積是采油廢水體積的2%0。
[0020]進一步地，步驟(4)中所述的曝氣池中按每天進水量補充尿素22g/m3和鈣鎂磷肥64g/m3，曝氣池通氣量為 0.004m3/s, DO 約 3.5 ~4.5mg/L。
[0021]本發明的有益效果是，(I)復合高效除油菌株可對采油廢水中的烴類化合物降解率在94%以上；
[0022](2)降解采油廢水的最適溫度為33~37 °C、pH為7.5~8.0、鹽度為L 3%~
1.50%、溶解氧為3.5~4.5mg/L,且所述復合菌株在外環境溫度會-7V的低溫及鹽度^ 40%、pH ^ 9.0的高鹽堿條件下仍具有良好的降解能力。
[0023](3)本發明所選用的菌種不僅各自高效的原油降解率，菌種之間還能起到協同作用，幾種細菌共同對原油進行降解效率遠大于單獨作用簡單疊加的效果，而且極容易適應所述油田現場的生化池降解環境，并具有持續循環性。
【具體實施方式】
[0024]下面結合具體實施例，進一步對本發明進行闡述，應理解，引用實施例僅用于說明本發明，而不用于限制本發明的范圍。
[0025]從金南油田采集污染土樣及原油采出液，將污染土樣及原油采出液中原油降解菌經馴化、分離和純化即得到本發明所使用的銅綠假單胞菌、枯草桿菌、門多薩假單胞菌和鮑氏不動桿菌。具體步驟如下:
[0026]1、取IOg油污土壤樣品，接入裝有250ml培養基(含有原油樣品為63 μ L)的500mL三角瓶中，PH7.5、33°C、150r/min搖床培養2d，取富集液5mL接種至相同新鮮培養基內，此時原油樣品增至70 μ L，于相同條件下培養2d，如此連續富集培養四次，且每一次轉接原油樣品都以7μ L的遞增速度增加，8d后得到馴化培養液；
[0027]或者取所述原油采出液250ml裝入500ml三角瓶中，加入對應無碳基礎鹽，pH7.5、33°C、150r/min搖床培養2d，取富集液5ml接種至相同新鮮培養基內，于相同條件下培養2d，如此連續富集培養四次，8d后得到馴化培養液。
[0028]2、在無菌條件下，分別取Iml上述得到的馴化培養液，用無菌水按倍數稀釋，取10_4、10_5、10_6三個梯度備用，吸取0.5mL菌懸液注入牛肉膏蛋白胨平板培養基內，用涂布棒均勻涂勻，每個梯度均做4只平行樣，待培養基表面液體被吸收后倒置放于恒溫培養箱內33°C條件下培養I~2d。
[0029]3、對所述平板每隔12小時觀察一次，并對平板內菌落生長數量和形態特征情況做好記錄。找出不同形態菌落，用接種環挑取單個菌落劃線接種至新鮮固體牛肉膏蛋白胨平板培養基內，避免帶入原來的基質，不同的菌株每株重復4個平行樣，繼續放于恒溫培養箱內33°C培養，如此連續劃線分離3次，得到單一典型菌落數株。
[0030]4、經生理生化實驗、16SrDNA的序列分析以及NCBI信息數據庫中的Blast比對分析鑒定出銅綠假單胞菌、枯草桿菌、門多薩假單胞菌和鮑氏不動桿菌即為本發明所采用幾種除油囷。
[0031]實施例1
[0032](I)將純化的單一的銅綠假單胞菌、枯草桿菌、門多薩假單胞菌和鮑氏不動桿菌菌株接種到牛肉膏蛋白胨培養基中，pH7.5、35°C、200r/min搖床培養18h，得到種子菌液；
[0033](2)制備富集菌液的馴化培養液，方法如下:
[0034]取種子菌液加入含有原油樣品的培養基，pH7.5、33°C、150r/min搖床培養2d，培養基中原油樣品體積含量為1.5%，接種至新鮮的含有原油樣品的培養基中；重復上述步驟4次，每一次轉接的培養基內原油樣品體積含量都以5%。的速度遞增，8天后得到馴化培養液。
[0035]其中所述的培養基為組成及重量份數為:KH2P040.85份、K2HPO4L 55份、MgSO4.H2O0.5 份、CaCl20.1 份、NH4Cll.5 份、MnSO4.H2O0.5 份、FeSO4.H2O0.005 份、NH4SO40.1 份、H3BO30.01份、去離子水1000份；所述的原油樣品為120#溶劑油與渣油以質量比為1:3的
混合物。
[0036](3)將步驟(2)制備的馴化培養液加入發酵培養基中，其中馴化培養液體積為發酵培養基體積的2.5%，在pH7.5、35°C、250r/min條件下，培養24~48h，使發酵菌液細胞濃度^ 109CFU/mL ;所述的發酵培養基組分及重量份數為:水解植物蛋白粉WA — 310份、牛肉膏5份、NaC15份、去離子水1000份；
[0037](4)將發酵菌液投入曝氣池中進行采油廢水的處理，發酵菌液體積是采油廢水體積的2%。，曝氣池中按每天進水量補充尿素22g/m3和鈣鎂磷肥64g/m3，曝氣池通氣量為
0.004m3/s, DO 約 3.5mg/L。
[0038]本實施例中加入曝氣池中的采油廢水含油量約90.lmg/L，控制曝氣池內溫度為33~370C、pH為7.5~8.0、鹽度為1.3%~1.50%,定期檢測，結果如下:降解24h后檢測濃度為11.62mg/L,降解率達到87.1%，降解48h后檢測濃度為4.86mg/L,降解率達到94.6%，出水指標達到SY/T5329-94中Al級標準，滿足低滲透油田注入水水質要求。
[0039]實施例2
[0040](I)將純化的單一的銅綠假單胞菌、枯草桿菌、門多薩假單胞菌和鮑氏不動桿菌菌株接種到牛肉膏蛋白胨培養基中，pH7.5、35°C、200r/min搖床培養18h，得到種子菌液；
[0041](2)制備富集菌液的馴化培養液，方法如下:
[0042]取原油采出液，向其中加入對應無碳基礎鹽培養基和種子菌液，原油采出液與無碳基礎鹽培養基體積比為1:5，pH7.5、33°C、150r/min搖床培養2d ;取上述培養得到的培養液接種至相同的新鮮原油采出液和培養基內，于相同條件下培養2d，如此連續富集培養四次，8d后得到馴化培養 液。
[0043]所述的無機基礎鹽培養基組份及重量份數為:KH2P0448.28份、K2HP0450.10份、MgSO4.7Η2013.41 份、CaCl2L 20 份、ΚΝ0375.75 份、FeSO4.7Η2015.15 份、Na2EDTA3.72 份、MnSO4.H2Ol.69 份、H3BO3L 22 份和去離子水 1000 份。
[0044](3)將步驟(2)制備的馴化培養液加入發酵培養基中，其中馴化培養液體積為發酵培養基體積的2.5%，在pH7.5、35°C、250r/min條件下，培養24~48h，使發酵菌液細胞濃度^ 109CFU/mL ;所述的發酵培養基組分及重量份數為:水解植物蛋白粉WA — 310份、牛肉膏5份、NaC15份、去離子水1000份；
[0045](4)將發酵菌液投入曝氣池中進行采油廢水的處理，發酵菌液體積是采油廢水體積的2%。，曝氣池中按每天進水量補充尿素22g/m3和鈣鎂磷肥64g/m3，曝氣池通氣量為
0.004m3/s, DO 約 4.5mg/L。
[0046]本實施例中加入曝氣池中的采油廢水含油量為91.450mg/L，控制曝氣池內溫度為33~370C、pH為7.5~8.0、鹽度為1.3%~1.50%,定期檢測，結果如下:降解24h后檢測濃度為9.209mg/L,降解率達到89.93%，降解48h后檢測濃度為4.48mg/L,降解率達到95.1%，出水指標達到SY/T5329-94中Al級標準，滿足低滲透油田注入水水質要求。
[0047]當外環境溫度3 _7°C的低溫:12月至來年一月份，淮安金湖的室外溫度為O度左右，集裝箱內的生化池沒有加熱保溫措施，生化池的進水溫度為20°C左右，生化池內水溫在微生物的生命活動作用下約28°C，降解48h，生化池內原油降解率及COD降解率均高達85%以上。
[0048]鹽度=40%、pH ^ 9.0的高鹽堿條件:在實驗室探究該復合菌群降解采油廢水的最優無機鹽配比的初期，發現在N源蘭5000mg/L, P源蘭4000mg/L, pH約9.0左右時，降解48h，原油降解率仍可保持在75%左右，此時測水中鹽度=40%，且水中有銨鹽等的結晶。[0049]對比實施例1
[0050]按照實施例2的方法，分別對銅綠假單胞菌、枯草桿菌、門多薩假單胞菌和鮑氏不動桿菌進行馴化，最后將馴化后的四種菌先后加入同一采油廢水中，加入另一種菌前使前一種菌失活(加熱等)，每種菌均分都為24h或48h。經檢測:每種菌都作用24h時，最終含油量由91.450mg/L將低到41.188mg/L,降解率只有55.12% ;每種菌都作用48h時，最終含油量由91.450mg/L將低到28.8lmg/L,降解率只有68.5%。
[0051]對比實施例2
[0052]按照實施例2的方法，所使用的細菌為枯草桿菌、門多薩假單胞菌和鮑氏不動桿菌，其他條件不變。經檢測:降解24h時，最終含油量由91.450mg/L將低到36.0 lmg/L,降解率只有60.62% ；降解48h時，最終含油量由91.450mg/L將低到22.04mg/L,降解率只有75.9%。
[0053]由以上結果可以看出，本發明采用四種菌同時對采油廢水進行處理效果遠大于四種菌單獨對采油廢水進行處理的效果，而且若去掉其中任何一種細菌其降解效果都遠不如本發明，說明四種菌在降解采油廢水時存在協同作用。
[0054]以上述依據本發明的理想實施例為啟示，通過上述的說明內容，相關工作人員完全可以在不偏離本項發明技術思想的范圍內，進行多樣的變更以及修改。本項發明的技術性范圍并不局限于說明書上的內容，必須要根據權利要求范圍來確定其技術性范圍。
【權利要求】
1.一種石油降解菌協同降解采油廢水的方法，其特征在于:包括如下步驟: (1)將純化的單一的銅綠假單胞菌、枯草桿菌、門多薩假單胞菌和鮑氏不動桿菌菌株接種到牛肉膏蛋白胨培養基中，pH7.5、35°C、200r/min搖床培養18h，得到種子菌液； (2)制備種子菌液的馴化培養液； (3 )將步驟(2 )制備的馴化培養液按等體積比加入發酵培養基中，在P H 7.5、3 5 °C、.250r/min條件下，培養24~48h，使發酵菌液細胞濃度≥109CFU/mL ； (4)將發酵菌液投入曝氣池中進行采油廢水的處理。
2.根據權利要求1所述的石油降解菌協同降解采油廢水的方法，其特征在于:步驟(2)所述的馴化培養液制備方法如下: 取種子菌液加入含有原油樣品的培養基，PH7.5、33°C、150r/min搖床培養2d，培養基中原油樣品體積含量為1.5%，接種至新鮮的含有原油樣品的培養基中；重復上述步驟4次，每一次轉接的培養基內原油樣品體積含量都以5%。的速度遞增，8天后得到馴化培養液。
3.根據權利要求2所述的石油降解菌協同降解采油廢水的方法，其特征在于:所述的培養基為組成及重量份數為=KH2PO40.85份、K2HPO4L 55份、MgSO4.H2O0.5份、CaCl20.1份、NH4Cll.5 份、MnSO4.H2O0.5 份、FeSO4.H2O0.005 份、NH4SO40.1 份、H3BO30.01 份和去離子水.1000 份； 所述的原油樣品為 120#溶劑油與渣油以質量比為1:3的混合物。
4.根據權利要求1所述的石油降解菌協同降解采油廢水的方法，其特征在于:步驟(2)所述的馴化培養液制備方法如下: 取原油采出液，向其中加入無碳基礎鹽培養基和種子菌液，原油采出液與無碳基礎鹽培養基體積比為1:5，pH7.5、33°C、150r/min搖床培養2d ;取上述培養得到的培養液接種至相同的新鮮原油采出液和無碳基礎鹽配制成的培養基內，于相同條件下培養2d，如此連續富集培養四次，8d后得到馴化培養液。
5.根據權利要求4所述的石油降解菌協同降解采油廢水的方法，其特征在于:所述的無碳基礎鹽培養基組份及重量份數為:KH2P0448.28份、K2HP0450.10份、MgSO4.7H2013.41份、CaCl2L 20 份、ΚΝ0375.75 份、FeSO4.7Η2015.15 份、Na2EDTA3.72 份、MnSO4.H2Ol.69 份、H3BO3L 22份和去離子水1000份。
6.根據權利要求1所述的石油降解菌協同降解采油廢水的方法，其特征在于:步驟(3)中所述的馴化菌液體積為發酵培養基體積的2.5% ;所述的發酵培養基組分及重量份數為:水解植物蛋白粉WA — 310份、牛肉膏5份、NaC15份和去離子水1000份。
7.根據權利要求1所述的石油降解菌協同降解采油廢水的方法，其特征在于:步驟(4)中所述的發酵菌液體積是采油廢水體積的2%0。
8.根據權利要求1所述的石油降解菌協同降解采油廢水的方法，其特征在于:步驟(4)中所述的曝氣池中按每天進水量補充尿素22g/m3和鈣鎂磷肥64g/m3，曝氣池通氣量為.0.004m3/s, DO 約 3.5 ~4.5mg/L。
【文檔編號】C02F103/10GK103803714SQ201410069428
【公開日】2014年5月21日 申請日期:2014年2月27日 優先權日:2014年2月27日
【發明者】馮俊生, 楊懷成, 常杰云, 劉兆躍, 秦學成, 陳皓, 程漢東 申請人:常州大學