測定竹紅菌甲素含量的高效液相色譜方法

專利名稱：：測定竹紅菌甲素含量的高效液相色譜方法
技術領域：
：本發明涉及藥物分析
技術領域：
，具體是一種測定竹紅菌甲素(HypocrellinA)含量的高效液相色譜(HPLC)方法。
背景技術：
：光動力療法(PhotodynamicTher即y，PDT)是一種新型臨床治療技術，其發展始于20世紀70年代用于腫瘤的臨床診斷和治療研究，隨著對其作用機制的深入了解，在90年代開始用于治療鮮紅斑痣、微血管類疾病、視網膜黃斑變性等。從1993年加拿大首先批準光敏藥物Photofrin應用于膀胱癌和食管癌的光動力治療以來，光動力療法在很多國家獲得批準，眾多病人受益于光動力療法。作為一種新型療法，PDT是將光敏劑導入體內并讓它在組織間分布，然后用與光敏劑吸收光譜相匹配的光照射靶組織，在氧的參與下產生對靶組織的破壞。PDT的關鍵在于光敏活性化合物的獲得以及光的參與，并因而獲得雙重選擇性，也因選擇性的獲得而在臨床治療上具有高效性和安全性。竹紅菌甲素(HypocrellinA，HA)是從云南民族藥竹紅菌(竹生小肉座菌Hypocrellabambusae的干燥子座]中首先發現的一種菲醌類新型天然光敏劑，其化學結構如附圖l所示(萬象義等，一種新的光化學療法藥物一竹紅菌甲素，科學通報，1980年第24期，1148頁；TadashiKishetal，NewPerylenequinonesfromShiraiabambusicola，PlantaMed，1991年，第57巻，376頁)。HA的光敏活性具有光毒性高、暗毒性低、易排泄等優點，以其為主要有效成分開發的民族藥制劑竹紅菌軟膏，在臨床上已用來治療外陰白色病變、軟化疤痕疙瘩、鮮紅斑痣等，是一種具有發展前景的新型光療藥物(徐尚杰等，新型光動力藥物一竹紅菌素衍生物的研究與進展，科學通報，2003年第10期，1005頁；魏玉德，竹紅菌素研究的進展，中國實用醫藥，2008年第3期，147頁)。有關HA定量分析的研究，主要有(1)分光光度法利用HA在紫外-可見光區具有吸收的性質，以測定其吸光值來定量。因發色團相似的化合物均具有類似吸收曲線，該方法容易受雜質，尤其是同類物質的干擾，專屬性差，已不適應藥物分析的實際需求。(2)高效液相色譜法利用色譜柱先將HA和其它成分分離，再利用其理化性質檢測含量，是目前主流的分析技術，有以下的報道①發明專利"高效液相色譜法測定竹紅菌甲素含量的方法"(專利號ZL200410065986.7)和論文"高效液相色譜熒光檢測法測定竹紅菌中竹紅菌甲素的含量"(顧曉天等，藥物分析雜志，2006年，第1期，68頁)用甲醇-水=83:17為流動相分離，以熒光發射性質檢測進行定量分析。②論文"HPLC法測定光療藥物竹紅菌乙素的含量"(安紅波等，黑龍江八一農墾大學學報，2009年，第3期，70頁)用甲醇-水=83:17為流動相，在300nm處檢測紫外吸收進行定量分析。③論文"竹紅菌中竹紅菌乙素的提取及其含量的測定"(周林，南京師范大學學報，2007年，第2期，122頁)用乙腈-KH2P04(0.02mmol/L)=70:30為為流動相，在300nm處檢測紫外吸收進行定量分析。但經過本發明人系統的研究，結果表明上述專利或論文所確定的主要技術條件有嚴重缺陷，在實際的生產應用中，存在這以下弊端(1)所選用的流動相甲醇-水=83:17，或者乙腈-KH2P04(0.02mmol/L)=70:30，均不能很好分離樣品中HA，圖譜中HA峰傾斜，對稱度達不到《中國藥典》2005年版一部附錄VID對于HPLC分析拖尾因子在0.951.05之間的要求。(2)上述方法①采用的熒光檢測器，為不常用儀器，適用面窄。方法①中專利技術只選用雙封端保證很低硅羥基活性的ZorbaxExtendC18柱，適用面窄，且此類色譜柱一般價格較高，增加了分析成本。(3)上述方法②、③采用在300nm處檢測紫外吸收，而HA的紫外-可見吸收曲線(如附圖2所示)在300nm不是吸收峰，不適宜用作定量分析的檢測波長。為尋求對于HA更科學合理，更具有適用性的藥物分析方法，本發明人經過系統的對比研究，提供了一種不同于上述專利或論文所公布的，可用于測定中藥材或者其制劑產品中HA含量的HPLC方法。
發明內容本發明的目的是為準確地分析測定中藥材及其制劑中HA的含量，更好地控制藥品質量，保障臨床用藥安全有效，提供一種測定竹紅菌甲素含量的高效液相色譜方法。本發明通過以下的技術方案實現1.HPLC分析檢測方法和檢測波長的確定HA在紫外_可見區有吸收(附圖2)，可用紫外_可見檢測器直接檢測，這也是最常用、最普及的檢測方法和儀器，考慮到應用普遍性，優先采用此檢測方法。適量HA溶解于甲醇或HPLC流動相中，制成約lmg/100mL的溶液，用分光光度計在200800nm波長范圍內掃描紫外_可見光譜，結果表明HA吸收曲線有6個吸收峰(附圖2):581.0、540.5、462.0、342.5、266.5、231.Onm，其中以462nm處的吸收峰干擾少且較平坦，隨后的HPLC分析也明確，在此檢測波長下的HPLC圖譜沒有雜質干擾，故此確定用紫外檢測法，檢測波長462nm。2.HPLC分析色譜柱的選擇十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱(C-18柱)是HPLC分析最常用、性價比最高的色譜柱系列，考慮到應用普遍性，比較了不同廠牌、型號C-18柱(大連依利特公司C-18柱，Phenomenex公司C-18柱、Merck公司C-18柱)的分離效果，結果表明在本發明分析條件下，對中藥材及制劑中HA的含量分析沒有明顯區別，均能很好的實現定量分析。因此確定選用以碳十八烷基鍵合硅膠為填充劑的色譜柱。3.HPLC分析流動相的篩選選擇合適的流動相以得到良好分離效果是HPLC分析的關鍵，基于一般的公知事實和工作經驗，在HPLC分析中最常用的溶劑有甲醇、乙腈等，調節流動相酸堿性的常用試劑有磷酸、甲酸、二乙胺、三乙胺等。根據理化性質和經驗，選擇甲醇-水、乙腈-水系統為基礎，輔以磷酸等調節酸性來對比篩選分析中藥材及其制劑中HA含量的流動相組成和配比。篩選選用Phenomenex公司C-18柱(①4.6X150mm，5ym，使用pH范圍為1.5IO)，流速1.0ml/min;柱溫30°C;檢測波長642nm。對比研究數據及其分析結果見表一。表一HA含量HPLC分析的流動相對比篩選試驗評價結果<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>結果表明流動相以甲醇-稀磷酸(或甲酸、乙酸、硫酸)組成的混合溶劑具有最好分離效果；稀酸的適宜濃度為0.04%0.30%，甲醇和稀酸的體積比在80:2070:30之間均可，優化的流動相比例是75:25。在優化條件下，HA對照品和竹紅菌藥材的HPLC圖譜見圖3、圖4。藥材分析圖譜中HA吸收峰保留時間為13.42min，理論板數6910，拖尾因子1.031，分離度為2.731。4.竹紅菌藥材供試液的制備竹紅菌甲素等茈醌類成分不溶于水，可溶于丙酮、氯仿、乙醇等有機溶劑，因此，從藥材中提取竹紅菌甲素不宜用水為溶劑，而應該用有機溶劑提取。不同提取方法測定結果比較見表二。表二竹紅菌藥材的提取方法比較<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>結果表明丙酮、氯仿具有較好溶解性，乙醇、甲醇稍差；回流提取優于超聲處理。由于氯仿有一定毒性而丙酮無毒，由此確定從藥材中提取竹紅菌甲素供試品的制備方法為取藥材，粉碎，加丙酮回流提取，濾過，即得。5.測定的專屬性對照品加入在竹紅菌藥材及其制劑的供試液中，混入對照品溶液進樣測定，和供試液色譜對照，無新的吸收峰出現，竹紅菌甲素吸收峰相對面積增大。吸收峰光譜掃描以二極管陣列檢測器(DAD)，掃描樣品色譜中和對照品峰相同位置的吸收峰，峰純度950以上，紫外光譜和對照品一致。以上試驗證明測定的吸收峰對應的物質是竹紅菌甲素，該含量測定方法具有專屬性。6.測定的方法學考察(1)穩定性試驗對照品、供試品溶液于放置后不同時間測定，結果表明對照品溶液至少在48h內穩定(峰面積RSD=0.57%，n=7)，供試品溶液至少在48h內穩定(峰面積RSD=0.41%，n=7)，可滿足含量測定需求。(2)檢測限和線性關系精密稱取竹紅菌甲素對照品適量，用流動相制成lmg/ml儲備液，不斷稀釋后測定最低檢測限為0.4ng(信號/噪聲=3)，測定方法靈敏。在分別取儲備液稀釋為不同濃度，測定。以進樣量和峰面積關系的回歸方程Y=1317062X+7597(n=7，r=0.9999，Y:峰面積；X:進樣量iig)，在進樣量在0.04iig4.0iig范圍內，竹紅菌甲素的量與峰面積呈良好的線性關系。(3)重現性試驗精密稱取同一批號的竹紅菌藥材粉末約lg，共5份，按上述竹紅菌藥材供試品溶液制備方法制備溶液，各進樣20iU測定竹紅菌甲素峰面積并計算含量。樣品中竹紅菌甲素平均含量為30.34mg/g，RSD=0.14%，方法重現性符合要求。(4)回收率試驗精密稱取已知含量竹紅菌藥材(樣品6)粉末6份，每份約lg，分成三組，分別加入3.6mg/mL的對照品溶液7mL，8.5mL，10mL，按照竹紅菌藥材供試品溶液的制備方法制成供試品溶液，分別進樣測定竹紅菌甲素的含量，計算回收率。平均回收率為100.46%，RSD=1.69%(表6)，符合要求。7、分析方法耐用性試驗(1)流速變化對測定結果的影響保持色譜柱、柱溫、檢測波長、流動相不變，流速設定為0.8、1.0、1.2ml/min分別進行測定。同一竹紅菌藥材樣品含量為3.33%、3.34%、3.34%，結果表明流速改變達到±20%時，仍可準確測定樣品中竹紅菌甲素的含量。(2)檢測波長偏移對測定結果的影響保持色譜柱、柱溫、流動相、流速不變，檢測波長設定為459、462、465nm分別測定。同一竹紅菌藥材樣品含量為3.32%、3.32%、3.33%，結果表明當檢測波長偏移達到±3nm時，仍可準確測定樣品中竹紅菌甲素的含量。(3)流動相比例改變對測定結果的影響保持色譜柱、柱溫、檢測波長、流速不變，適當改變流動相的組成比例進行試驗(甲醇-0.08%磷酸=72:28、75:25、78:22)，結果表明流動相比例改變達到±3%的情況下，仍可準確測定樣品中竹紅菌甲素的含量。8、測定方法按照上述研究確定的分析方法，制備竹紅菌甲素對照品溶液，含竹紅菌甲素的中藥材及其制劑的供試溶液。精密吸取對照品溶液、供試溶液，注入液相色譜儀，測定，根據峰面積計算，即得。與現有技術比較，本發明具以下的有益效果(1)經過系統的比較研究，建立了一種測定竹紅菌甲素含量的高效液相色譜方法，可用于測定含竹紅菌甲素的藥材、制劑中竹紅菌甲素的含量。(2)該分析方法具有分離效果好，測定準確、靈敏，專屬性強，測定快速等技術特點。含竹紅菌甲素的藥材、制劑中竹紅菌甲素的吸收峰可在30分鐘內全部流出色譜柱，完成分析工作。(3)和目前已公開的分析方法比較，本發明確定了不同的流動相組成，選定了不同的檢測波長，避免了已公開分析方法的缺陷，可直接應用于實際生產過程及含竹紅菌甲素的中藥材、制劑產品的質量分析。圖1是竹紅菌甲素的化學結構式；圖2是竹紅菌甲素的紫外_可見吸收曲線；圖3是竹紅菌甲素對照品的HPLC圖譜；圖4是竹紅菌藥材的HPLC圖譜。具體實施例方式以下的具體實施例可進一步說明本發明及其應用，但并不構成對本發明權利要求所保護的范圍的限制。工作原理和過程供試液注入液相色譜儀，流動相載著竹紅菌甲素等成分進入色譜柱并分離后依次到達檢測器被識別；檢測器測定樣品中竹紅菌甲素吸收峰的響應值，并根據響應值和竹紅菌甲素標樣的比較來計算樣品中竹紅菌甲素的含量。實施例1:竹紅菌藥材中竹紅菌甲素的含量測定取竹紅菌藥材，粉碎，過60目篩網，精密稱取lg，置100ml圓底燒瓶中，準確加入丙酮50ml，稱重，水浴回流提取1小時，放冷，以丙酮補足減失的重量，過濾，即得供試溶液。取竹紅菌甲素適量，精密稱定，以無水甲醇溶解制成每lml含有30iig竹紅菌甲素的對照品溶液。按照本發明研究確定的方法，精密吸取對照品溶液、供試溶液，注入液相色譜儀，測定，即得。其中，色譜柱以碳十八烷基鍵合硅膠為填充劑，檢測波長為462nm，流動相為甲醇和質量百分比為0.08%稀磷酸組成的混合溶液，甲醇和稀磷酸組成的體積比為75:25。不同產地的竹紅菌藥材中竹紅菌甲素含量測定的結果見表三。表三不同產地竹紅菌藥材中竹紅菌甲素含量測定結果<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>實施例2:竹紅菌藥材中竹紅菌甲素的含量測定取竹紅菌藥材(寧蒗縣產，批號20071201)，粉碎，過60目篩網，精密稱取lg，置100ml圓底燒瓶中，準確加入丙酮50ml，稱重，水浴回流提取1小時，放冷，以丙酮補足減失的重量，過濾，即得供試溶液。取竹紅菌甲素適量，精密稱定，以無水甲醇溶解制成每lml含有30iig竹紅菌甲素的對照品溶液。采用以碳十八烷基鍵合硅膠為填充劑的色譜柱，462nm檢測波長，分別以表四中的混合溶劑為流動相，進行竹紅菌甲素含量分析。精密吸取對照品溶液、供試溶液，注入液相色譜儀，測定，即得。分別使用不同流動相測定同一份竹紅菌藥材(寧蒗縣產，批號20071201)中竹紅菌甲素結果如表四。表四用不同流動相測定竹紅菌藥材中竹紅菌甲素的含量<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>實施例3:竹黃藥材中竹紅菌甲素的含量測定方法同實施例l，測定的藥材為竹黃，不同產地竹黃藥材中竹紅菌甲素的含量測定結果見表五。表五不同產地竹黃藥材中竹紅菌甲素含量測定結果<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>實施例4:竹紅菌軟膏中竹紅菌甲素的含量測定精密稱區竹紅菌軟膏lg，置于磨口三角瓶中，再加約2g硅藻土攪散軟膏，然后精確加入無水甲醇50mL，稱重，于水浴上回流提取1小時，放冷，用無水甲醇補足減失的重量，再密封后置于4t:冰箱中放置過夜，取出，上清液濾過，取續濾液，過0.45um濾膜，即得供試品溶液。余下的分析操作步驟同實施例1、2。不同廠家、批號的竹紅菌軟膏中竹紅菌甲素含量測定結果見表六。表六不同廠家、批號的竹紅菌軟膏中竹紅菌甲素含量測定結果<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>權利要求一種測定竹紅菌甲素含量的高效液相色譜(HPLC)方法，其特征是HPLC條件為色譜柱以碳十八烷基鍵合硅膠為填充劑，流動相為甲醇-稀磷酸或甲醇-稀甲酸或甲醇-稀乙酸或甲醇-稀硫酸組成的混合溶劑，甲醇與稀磷酸或稀甲酸或稀乙酸或稀硫酸的體積比為80∶20～70∶30，檢測波長為462nm。2.根據權利要求l所述的測定竹紅菌甲素含量的高效液相色譜(HPLC)方法，其特征是流動相中稀酸的適宜濃度為質量百分比0.04%0.30%。3.根據權利要求l所述的測定竹紅菌甲素含量的高效液相色譜(HPLC)方法，其特征是流動相為甲醇和質量百分比為0.08%稀磷酸組成的混合溶液，甲酸和稀磷酸組成的體積比為75:25。全文摘要本發明是一種測定竹紅菌甲素(HypocrellinA)含量的高效液相色譜(HPLC)方法。液相色譜條件為色譜柱以碳十八烷基鍵合硅膠為填充劑，流動相為甲醇-稀磷酸(或稀甲酸、稀乙酸、稀硫酸)組成的混合溶劑，甲醇與稀磷酸(或稀甲酸、稀乙酸、稀硫酸)的體積比為80∶20～70∶30，檢測波長462nm。本發明克服了已有分析方法的缺陷，可直接應用于含竹紅菌甲素的中藥材以及制劑中竹紅菌甲素的定量分析。該方法具有分離效果好，測定準確、靈敏，專屬性強，測定快速等技術特點。含竹紅菌甲素的藥材、制劑中竹紅菌甲素的吸收峰可在30分鐘內全部流出色譜柱，完成分析工作。文檔編號G01N30/02GK101710070SQ20091021828公開日2010年5月19日申請日期2009年12月7日優先權日2009年12月7日發明者張慧穎,李俊,鄭立雄,饒高雄申請人:昆明振華制藥廠有限公司