專利名稱：用于肥料和肥料添加劑中雙氰胺的測定方法
技術領域：
本發明涉及一種(應用高效液相色譜法)檢測雙氰胺含量的方法，特別是一種用于肥料和肥料添加劑中雙氰胺的測定方法(高效液相色譜檢測法)。
背景技術：
雙氰胺(D⑶)，也稱為二氰二胺，是一種已被公認價廉質優的硝化抑制劑，是在生產實際中得到應用的為數不多的硝化抑制劑之一。1918年首次報道雙氰胺具有硝化抑制特征，上世紀七、八十年代美國開始把它作為一種硝化抑制劑商品在農業上推廣應用，前西德SKW公司利用雙氰胺注冊了商品名為Didin的硝化抑制劑產品，國內中國科學院沈陽應用生態研究所等科研院所以及部分肥料生產企業，也都利用雙氰胺生產長效新型肥料、穩定性肥料、肥料增效劑等產品。當前雙氰胺已在國內外廣泛應用于緩釋肥料或肥料添加劑的生產，系列產品受到世界各國的關注，尤其是在中國、美國和歐洲的市場上。雙氰胺在肥料或肥料添加劑的生產過程中，部分將分解產生氨(雙氰胺水溶液在 80°c以上時易分解)，必將影響著肥料或肥料添加劑成品中雙氰胺的含量，從而影響其應用效果。農田雙氰胺的應用，大多的研究結果支持適量的雙氰胺對環境和作物無毒害作用的結論(雙氰胺在土壤中70天左右降解)，但也有研究表明，雙氰胺易隨水淋失，施用不當或過量時，容易對作物造成毒害甚至在農產品中殘留。雙氰胺在肥料或肥料添加劑加工生產中降解情況如何，含有雙氰胺的肥料或肥料添加劑中的雙氰胺淋失進入水體為人體吸入， 以及過量雙氰胺導致的農殘為人體食用是否會影響人類健康目前尚無確切報道。雙氰胺微毒或基本無毒，急性毒性很小，在藥品生產上，雙氰胺作為藥物加工中間體，是國內外藥物成品中必要的檢測項。雙氰胺作為單氰胺的二聚體，其對小鼠毒害癥狀與單氰胺三聚體三聚氰胺類似，13000mg/kg劑量的雙氰胺和三聚氰胺給藥后的小鼠出現一致毒害癥狀，均出現不安，跳躍，呼吸急促，隨后在幾十分鐘內便死亡。含雙氰胺的肥料或肥料添加劑長期或過量施用，其中的雙氰胺是否會像三聚氰胺成為一種潛在的危險試劑目前不得而知。因此，雖然目前尚未發現農業生產上出現的施用含雙氰胺的肥料或肥料添加劑引起的淋失和農殘的現象，盡管如此，鑒于雙氰胺作為藥物的必要檢測項，以及其具有與三聚氰胺相似的小鼠毒害癥狀，科研人員和生產應用者很有必要對廣泛應用于肥料或肥料添加劑生產中的雙氰胺進行監測，明確雙氰胺的實際含量，防患于未然。目前國內應用高效液相色譜法對雙氰胺的測定，都集中在對藥物如鹽酸二甲雙胍片、鹽酸苯乙雙胍等中雜質雙氰胺的檢測，其中雙氰胺主要是作為藥物加工中間體使用，檢測方法大多參照2005年版《中華人民共和國藥典》中的方法或修訂的方法來測定雙氰胺含量。這些方法的不足之處在于，色譜柱價格較高、壽命短，色譜分離時雙氰胺峰(峰值)的保留時間較短，難于與溶劑峰基線分離，專屬性不夠強，色譜條件重現性欠佳，檢測限較高， 檢測靈敏度較低，難以滿足微量雙氰胺的檢測要求等等。此外，更為關鍵的是應用其中某些方法的色譜條件來檢測肥料中的雙氰胺含量，未能很好的將雙氰胺色譜峰與其它雜峰分開。我國目前對雙氰胺作為硝化抑制劑添加入肥料或作為肥料添加劑成分之一的監測尚缺乏，即針對肥料或肥料添加劑中雙氰胺含量的檢測尚缺乏，因此，很有必要結合我國的實際情況，探索一種適合于肥料和肥料添加劑中雙氰胺的檢測方法。
發明內容
本發明的目的是提供一種用于肥料和肥料添加劑中雙氰胺的測定方法(高效液相色譜檢測法)，使得成為一種檢測限低、檢測靈敏度高、回收率高和快速的高效液相色譜檢測法。本發明的創新思路是采用高效液相色譜法對肥料和肥料添加劑中雙氰胺含量進行檢測時，都需要摸索和尋找合適的色譜條件，包括色譜柱、流動相、流速、進樣體積、柱溫、 柱壓、檢測波長等。此外，還需要確定一套與提取方法相匹配的檢測方法，這些都直接關系到提取和檢測方法的回收率、準確性和靈敏度。所以，為了實現上述目的，本發明需要探索建立一種適用于肥料和肥料添加劑中雙氰胺的提取條件和新的色譜條件。鑒于以上創新思路，本發明所提供的一種用于肥料和肥料添加劑中雙氰胺的測定方法，其特征在于該測定方法包括如下步驟①備好雙氰胺標準溶液，及樣品前處理其中樣品前處理是指稱取定量的樣品(包括肥料樣品和/或肥料添加劑樣品)，加入2倍體積的超純水，超聲提取離心后，上清液經過濾器過濾后得到樣品濾液，加水定容；②樣品測定 將樣品濾液和備好的雙氰胺標準溶液分別注入高效液相色譜中，按照色譜條件測定標準溶液和樣品中雙氰胺吸收峰面積；③結果計算通過雙氰胺標準溶液的濃度與對應吸收峰面
ν ν /-C
積的線性關系曲線，查得樣品濾液中雙氰胺的濃度，按照F = ^公式計算樣品中雙
m
氰胺的含量。式中W-試樣中雙氰胺的質量分數，mg/kg ；C-由標準曲線上查出的樣液中雙氰胺的濃度，ug/mL ；V-樣液最終定容體積，mL ；ts_分取倍數；m-試樣質量(烘干樣質量)，g。上述樣品處理為準確稱取10. 000-20. OOOg的肥料或肥料添加劑樣品，加入40mL 的超純水，超聲提取30min，提取液4000r/min離心lOmin，上清液用0. 45um的針頭式過濾器過濾，過濾后定容至50mL。上述雙氰胺標準溶液制備為準確稱取0. OOlg雙氰胺分析純試劑，用超純水定容至100ml，得Cfe= 100ug/mL，置于4°C冰箱中保存。上述使用儀器為Waters Alliance沈95二極管陣列檢測器，色譜條件為色譜柱采用Waters XTerra RP-18 (4. 6mmX 150mm, 5um)；流動相A為乙腈，流動相B為四丁基硫酸氫銨((C4H9)4NHSO4)和磷酸二氫鈉(NaH2PO4)混合液，流動相A與流動相B的體積比為(流動相A 流動相B為)5 95，流速為0. 7000mL/min,進樣體積為IOuL ；柱溫為30°C，柱壓為 14Mpa,紫外檢測波長為220nm。上述高效液相色譜法在2. 60-3. 30min有一專一的色譜峰，該峰與標準溶液中的色譜峰一致，為雙氰胺的特征吸收峰。
由于目前國內應用高效液相色譜法測定雙氰胺主要是針對藥品中雜質雙氰胺的測定，若應用已有技術的樣品制備、色譜條件及檢測波長來測定肥料料和肥料添加劑中雙氰胺含量，其它物質可能與雙氰胺色譜峰有重疊，不能準確檢測雙氰胺含量。與現有技術相比，本發明具有以下優點本發明適用于肥料和肥料添加劑中雙氰胺含量的測定，且不受其它雜峰的干擾，該方法快速(方法簡單、易行)、靈敏度高(檢測的精度高)、檢測限低、回收率高。使用本發明的高效液相色譜法測定肥料和肥料添加劑中雙氰胺含量，提取過濾后的固體樣品檢測限為0. lmg/kg,回收率為91. 27% 98. 48%。
四
圖1為雙氰胺標準品色譜圖；圖2為一種含有雙氰胺的緩釋復合肥樣品色譜圖；圖3為一種含有雙氰胺的肥料添加劑樣品色譜圖。
五具體實施例方式利用高效液相色譜法對一種緩釋肥料和肥料添加劑中雙氰胺的含量進行檢測1、儀器設備Waters Alliance洸95高效液相色譜儀，配有Waters四96 二極管陣列檢測器。2、選用試劑乙腈(色譜純)；四丁基硫酸氫銨Qmmol/L)準確稱取0. 679g四丁基硫酸氫銨分析純試劑，用超純水定容至IOOOml ；磷酸二氫鈉05mmol/L)準確稱取3. OOOg磷酸二氫鈉分析純試劑，用超純水定容至 IOOOml ；雙氰胺標準液準確稱取0. OOlg雙氰胺分析純試劑，用超純水定容至100ml，得C 標=100ug/mL，置于4°C冰箱保存。3、操作步驟①樣品處理準確稱取10. 000-20. OOOg的緩釋肥料或肥料添加劑，加入一定量的超純水，超聲提取30min，提取液4000r/min離心lOmin，上清液用0. 45um的針頭式過濾器過濾，過濾后定容至50mL，供高效液相色譜測定。②樣品測定將雙氰胺標準溶液，樣品濾液注入高效液相色譜中，按照色譜條件測定標準溶液和樣品中雙氰胺吸收峰面積。色譜條件為色譜柱采用Waters XTerra RP-18 (4. 6謹X 150mm, 5um)；流動相A為乙腈，流動相B為四丁基硫酸氫銨((C4H9) 4NHS04) 和磷酸二氫鈉(NaH2PO4)混合液，流動相A與流動相B的體積比(流動相A 流動相B)為 5 95，流速為0. 7000mL/min,進樣體積為IOuL ；柱溫為30°C，柱壓為14Mpa，紫外檢測波長為 220nm。③標準曲線的繪制用流動相將雙氰胺標準儲備液逐級稀釋得到濃度為1、10、 25、50、75、100ug/mL的標準工業液，濃度由低到高進樣檢測，以峰面積-濃度作圖，得到標準曲線回歸方程。雙氰胺濃度在1 lOOug/mL范圍內，濃度與其對應的峰面積值呈良好線性關系，相關系數為0. 999。所得線性方程為:y = 134445x-102557(x為濃度，ug/mL ；y為峰面積，
UV * S)4、結果計算按如下公式計算妒=CxVxtS
m式中W-試樣中雙氰胺的質量分數，mg/kg ；C-由標準曲線上查出的樣液中雙氰胺的濃度，ug/mL ；V-樣液最終定容體積，mL ；ts-分取倍數；m-試樣質量(烘干樣質量)，g。以3倍信噪比(S/N)計算出的固體樣品檢出限為0. lmg/kg，以10倍信噪比(S/N) 計算出的固體樣品定量限為0. 33mg/kg。5、回收率設定3個添加量，將雙氰胺與肥料樣品充分混勻，對每個添加量重復測定6次。表1肥料添加雙氰胺的回收率
權利要求
1.一種用于肥料和肥料添加劑中雙氰胺的測定方法，其特征在于包括如下步驟①備好雙氰胺標準溶液，及樣品前處理其中樣品前處理是指稱取定量的樣品，加入2倍體積的超純水，超聲提取離心后，上清液經過濾器過濾后得到樣品濾液，加水定容；②樣品測定 將樣品濾液和備好的雙氰胺標準溶液注入高效液相色譜中，按照色譜條件測定標準溶液和樣品中雙氰胺吸收峰面積；③結果計算通過雙氰胺標準溶液的濃度與對應吸收峰面積的 線性關系曲線，查得樣品濾液中雙氰胺的濃度，按照# =-公式計算樣品中雙氰胺的m含量； 式中W"試樣中雙氰胺的質量分數，mg/kg ；C-由標準曲線上查出的樣液中雙氰胺的濃度，ug/mL ；V-樣液最終定容體積，mL ；ts-分取倍數；m-試樣質量(烘干樣)，g。
2.根據權利要求1所述的用于肥料和肥料添加劑中雙氰胺的測定方法，其特征在于 上述樣品處理為準確稱取10. 000-20. OOOg的新型肥料或肥料添加劑，加入40mL的超純水，超聲提取30min，提取液4000r/min離心lOmin，上清液用0. 45um的針頭式過濾器過濾， 過濾后定容至50mL。
3.根據權利要求1所述的用于肥料和肥料添加劑中雙氰胺的測定方法，其特征在于 上述雙氰胺標準溶液制備為準確稱取0. OOlg雙氰胺分析純試劑，用超純水定容至100ml， 得Cfe= lOOug/mL，于4°C冰箱中保存。
4.根據權利要求1所述的用于肥料和肥料添加劑中雙氰胺的測定方法，其特征在于上述使用儀器為Waters Alliance沈95 二極管陣列檢測器，色譜條件為色譜柱采用 WatersXTerra RP-18 (4. 6mmX 150mm, 5um)；流動相A為乙腈，流動相B為四丁基硫酸氫銨 ((C4H9)4NHSO4)和磷酸二氫鈉(NaH2PO4)混合液，動流相A與流動相B的體積比(流動相A 流動相B)為5 95，流速為0. 7000mL/min，進樣體積為IOuL ；柱溫為30°C，柱壓為14Mpa， 紫外檢測波長為220nm。
5.根據權利要求1所述的用于肥料和肥料添加劑中雙氰胺的測定方法，其特征在于 上述高效液相色譜法在2. 60-3. 30min有一專一的色譜峰，該峰與標準溶液中的色譜峰一致，為雙氰胺的特征吸收峰。
全文摘要
一種用于肥料和肥料添加劑中雙氰胺的測定方法，其特征在于包括如下步驟備好雙氰胺標準溶液，及樣品前處理其中樣品前處理是指稱取定量的樣品，加入2倍體積的超純水，超聲提取離心后，上清液經過濾器過濾后得到樣品濾液，加水定容；樣品測定將樣品濾液和備好的雙氰胺標準溶液注入高效液相色譜中，按照色譜條件測定標準溶液和樣品中雙氰胺吸收峰面積；結果計算通過雙氰胺標準溶液的濃度與對應吸收峰面積的線性關系曲線，查得樣品濾液中雙氰胺的濃度，按照公式計算樣品中雙氰胺的含量。本發明的優點是方法快速、易行；檢測限低(0.1mg/kg)；回收率高(91.27％～98.48％)。
文檔編號G01N30/02GK102384948SQ20111022010
公開日2012年3月21日 申請日期2011年7月28日 優先權日2011年7月28日
發明者倪沁顏, 廖要要, 張潘丹, 張青, 江枝和, 王煌平, 程廣強, 羅濤, 翁伯琦 申請人:福建省農業科學院土壤肥料研究所