本發明屬于生物工程技術領域，涉及一種分子印跡聚合物的制備，特別是一種對氯霉素分子具有特異性識別分子印跡聚合物的制備。
背景技術：
氯霉素（chloramphenicol，CAP）是一種廣譜性抗生素，有很強的殺菌能力。目前氯霉素已經廣泛應用于治療和預防家禽、家畜及水產品的疾病。但是長期使用可引起再生性障礙性貧血和其他惡性的血液病，如果嬰兒長期食用氯霉素污染的乳汁，可能會引起“灰嬰綜合癥”， 動物性食品與水產品中的氯霉素殘留對人體健康構成了很大的威脅。歐盟自1994年明確規定禁止在動物性食品中使用氯霉素，氯霉素的殘留限量標準為“ 零容許量”，同樣歐盟也嚴格規定肉中的氯霉素殘留量不得超過0.1 ng/g。我國也已經禁止將氯霉素及其鹽、酯用于食品動物。任何水產品、畜禽產品中氯霉素都是必檢項目。因此建立靈敏度高、選擇性強、簡便易行的動物源性食品氯霉素殘留的檢測方法是非常有必要的。
目前，氯霉素的檢測主要采用微生物法、酶聯免疫分析法、放射性免疫法、氣相色譜法（GC）、高效液相色譜法（HPLC）及質譜（MS）與色譜技術聯用（GC-MS、HPLC-MS)的相關檢測方法，但是上述方法通常存在預處理繁瑣、選擇性不高或價格過高等特點。分子印跡技術是一種高選擇性的仿生識別方法，以其操作簡單、聚合物的選擇性好、性能穩定、價格便宜等優點，用于固相萃取、色譜柱填料中。之前已有幾篇相關論文報道氯霉素分子印跡聚合物的制備。以氯霉素為模板分子本體聚合制備的印跡聚合物用于傳感器（J. L. Suárez-Rodríguez, M. E. Díaz-García, Biosensors & Bioelectronics 16 (2001) 955; M. L. Mena, L. Agüí, P. Martinez-Ruiz, et al., Anal. Bioanal. Chem., 376 (2003) 18）、HPLC和固相萃取（SPE）固定相（C. Schrimer, H. Meisel, J. Chromatogr. A, 1132 (2006) 325; X. Shi, A. Wu, S. Zhang, et al., J. Chromatogr. B, 850 (2007)24; C. Schrimer, H. Meisel, Anal. Bioanal. Chem., 392 (2008) 223; L. Guo, M. Guan, C. Zhao, H. Zhang, Anal. Bioanal. Chem., 392 (2008) 1431）以及結合質譜技術的LC-MS（J. F. Huang, H. J. Zhang, Y. Q. Feng, J. Agri. Food Chem., 54 (2006) 9279）或LC-MS//MS（R. Mohamed, J. Richoz-Payot, E. Gremaud, et al., Anal. Chem., 79 (2007) 9557）檢測食品中的氯霉素。但是均使用有機小分子為致孔劑。
離子液體作為一種集綠色、低熔點、寬電化學窗口、可設計具有催化效果于一身的新型溶劑，能溶解很多有機或無機物質，液態范圍寬（通常300 ℃時不分解），有較好的熱穩定性，在電化學、液-液萃取、分離過程、有機反應催化等領域有著廣泛的應用。目前，將離子液體用于分子印跡聚合的文獻很少。Wang 等將室溫離子液體作為介質用于溶膠-凝膠分子印跡整體柱的制備，并用于分離手性藥物S-萘普生(He-Fang Wang, Yi-Zhou Zhu, Xiu-Ping Yan, Ru-Yu Gao, and Jian-Yu Zheng. Adv. Mater.18 (2006) 3266 )。Booker 等以反式烏頭酸為模板分子，在離子液體1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽和1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽存在下，制備分子印跡聚合物，聚合物的選擇性比。
傳統方法有明顯提高(Kate Booker, Michael C. Bowyer, Clovia I. Holdsworth and Adam McCluskey. Chem. Commun. (2006) 1730。He等利用離子液體1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽作為溶劑和致孔劑，采用溶膠-凝膠及犧牲空間法制備了睪丸素的分子印跡聚合物(C. Y. He, Y. Y. Long, J. L. Pan, et al., Talanta,74 (2008) 1126)。Sun等以諾氟沙星為模板、離子液體1-丁基-3-甲基咪唑基四氟硼酸鹽([BMIm]BF4)為致孔劑合成了一種諾氟沙星分子印跡整體柱 （Xiangli Sun, Jia He, Guorui Cai, Anqing Lin, Wenjie Zheng, Xuan Liu, Langxing Chen, Xiwen He, Yukui Zhang, J. Sep. Sci. 33 (2010) 3786)。
技術實現要素：
本發明的目的在于，提供一種氯霉素分子印跡聚合物的制備方法，制備方法簡單、高效，分子印跡聚合物具有良好分散性、易研磨、分子識別選擇性能好。可作為固相萃取小柱填料，實現對氯霉素樣品預處理中的分離、富集。
本發明的技術方案如下：
本發明提供的氯霉素分子印跡聚合物的制備方法，包括如下步驟：
第一、先將模板分子溶解在離子液體1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽和四氫呋喃溶劑中，再加入功能單體與模板分子相互作用30min；形成模板-離子液體-功能單體復合物，再加入交聯劑、引發劑混合均勻；
其中，模板分子為氯霉素，功能單體為2-乙烯基吡啶，溶劑離子液體1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽([BMIM]BF4) 和四氫呋喃，交聯劑為乙二醇二甲基丙烯酸酯，引發劑為偶氮二異丁腈。1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽和四氫呋喃的體積之比為1：1-1：2；所述模板分子、功能單體、交聯劑的物質的摩爾量之比為1：4：20；溶劑的體積用量與模板分子氯霉素的摩爾量之比為6mL/mmol -12mL/mmol；引發劑質量與模板分子的摩爾量比為40 mg/mmol；
第二、上步混合均勻后，超聲脫氣，超聲作用時間為5min；通入氮氣，時間為10-15min；抽真空，在60℃恒溫水浴中，發生熱引發聚合24小時，得到分子印跡聚合物；
第三、將上步得到的分子印跡聚合物取出研磨、過篩，用有機溶劑除去模板分子，通過紫外檢測器直至檢測不出模板分子；真空干燥，得到氯霉素分子印跡聚合物。
第三步研磨過篩后形成平均粒徑為300-700 nm的聚合物；使用的有機溶劑為甲醇和乙酸的體積比為90：10的混合溶液；真空干燥前的聚合物用乙腈清洗三至五次，除去殘余的甲醇和乙酸。
真空干燥溫度為60℃，控制時長為24小時。
本發明的優點和積極效果：
本發明制備的氯霉素分子印跡聚合物為比較均勻的球狀結構，與傳統的以四氫呋喃有機溶劑相比，采用離子液體和四氫呋喃為混合溶劑具有如下的優點：
1、以離子液體和四氫呋喃為混合溶劑，，在合成的過程中離子液體對聚合物反應有很好的催化效果，另外還起到致孔劑的作用，得到的分子印跡聚合物粒徑在納米級，粒徑為300-700 nm。
2、合成的聚合物較之傳統致孔劑合成的聚合物松軟、易研磨且孔徑及顆粒較均勻。
3、分子印跡聚合物的選擇識別性能優于傳統方法。
從應用價值考慮，本發明所提供的氯霉素分子印跡聚合物可作為固相萃取小柱的填料萃取劑，實現對氯霉素的選擇性分離、富集和純化，克服目前通用色譜檢測方法雜質干擾嚴重的缺點。
附圖說明
圖1為離子液體1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸：四氫呋喃（1:1 V/V)為溶劑合成的分子印跡聚合物的形態掃描電鏡圖；
圖2為離子液體1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸：四氫呋喃（2:1 V/V)為溶劑合成的分子印跡聚合物的形態掃描電鏡圖。
具體實施方式
實施例1：
首先稱取0.25mmol模板分子氯霉素，將其溶解在含有3mL 離子液體([BMIM]BF4)和四氫呋喃安培瓶中，[BMIM]BF4)和四氫呋喃的體積比為1:1；然后將1mmol功能單體2-乙烯基吡啶也溶解在上述含有3mL 離子液體([BMIM]BF4)和四氫呋喃安培瓶中，振蕩30min，使模板和功能單體相互作用形成復合物，再向上述的溶液中加入5mmol交聯劑乙二醇二甲基丙烯酸酯（EDMA）和引發劑偶氮二異丁腈（AIBN） 10mg，并且摩爾比為氯霉素: 2-乙烯基吡啶: 乙二醇二甲基丙烯酸酯=1:4:20，離子液體的體積用量與模板分子氯霉素的摩爾量之比為6mL/mmol；混合均勻后，分子印跡溶液經過超聲脫氣，超聲10min，通入氮氣10min除氧，最后抽真空將安培瓶密封，然后將安培瓶在真空下密封，60℃水浴反應24小時。
將生成的聚合物研磨過篩，篩分出粒徑300-700 nm的聚合物分別用甲醇-乙酸(90：10 V/V)洗脫模板分子，直至用HPLC無法檢測出模板分子氯霉素。對產物繼續用乙腈做萃取劑，除去殘留在聚合物中的甲醇和乙酸。最后，在60℃ 恒溫真空干燥分子印跡聚合物，時間24小時以，除去殘留的乙腈。其發明效果如圖1所示。
實施例2：
首先稱取0.25mmol模板分子氯霉素，將其溶解在含有3mL 離子液體([BMIM]BF4)和四氫呋喃安培瓶中，[BMIM]BF4)和四氫呋喃的體積比為2:1；然后將1mmol功能單體2-乙烯基吡啶也溶解在上述含有3mL 離子液體([BMIM]BF4)和四氫呋喃安培瓶中，振蕩30min，使模板和功能單體相互作用形成復合物，再向上述的溶液中加入5mmol交聯劑乙二醇二甲基丙烯酸酯（EDMA）和引發劑偶氮二異丁腈（AIBN） 10mg，并且摩爾比為氯霉素: 2-乙烯基吡啶: 乙二醇二甲基丙烯酸酯=1:4:20，離子液體的體積用量與模板分子氯霉素的摩爾量之比為12mL/mmol；混合均勻后，分子印跡溶液經過超聲脫氣，超聲10min，通入氮氣10min除氧，最后抽真空將安培瓶密封，然后將安培瓶在真空下密封，60℃水浴反應24小時。
將生成的聚合物研磨過篩，篩分出粒徑300-400 nm的聚合物分別用甲醇-乙酸(90：10 V/V)洗脫模板分子，直至用HPLC無法檢測出模板分子氯霉素。對產物繼續用乙腈做萃取劑，除去殘留在聚合物中的甲醇和乙酸。最后，在60℃ 恒溫真空干燥分子印跡聚合物，時間24小時以，除去殘留的乙腈。其發明效果如圖2所示。