一種具有免疫保護性的鮑曼不動桿菌表面抗原SurA1的制作方法
【技術領域】 本發明設及一種細菌表面抗原重組蛋白，該蛋白設及疾病亞單位疫苗制備技術領域， 同時該蛋白是一種對細胞具有毒力的蛋白。具體設及一種鮑曼不動桿菌免疫保護性抗原的 鑒定，蛋白基因的克隆W及它編碼的重組蛋白在疫苗中的應用，同時該蛋白對人類肺上皮 細胞A549具有毒性。
【背景技術】 鮑曼不動桿菌（Acinetobacter baumannii)是一種重要的條件致病菌。近年來由于抗 生素濫用，且其耐藥性日益嚴重，已引起研究者的嚴重關注。A.baumannii主要引起呼吸道 感染，也可引發敗血癥、泌尿系感染、繼發性腦膜炎等。A. baumannii在多種嚴酷環境中分布 且可長期存活，對免疫缺陷患者威脅很大。 2011年吉林某雞場發生一起由于飼料污染鮑曼不動桿菌導致60000多只維雞發病、 3000多只維雞直接死亡的事件，造成嚴重的經濟損失。先前該家公司先后發生3次類似事 件，損失都很嚴重。我們課題組經過剖檢、病理觀察、病原分離、菌株形態觀察和生理生化試 驗W及基因序列測定等手段，鑒定引起此次維雞死亡的病原為鮑曼不動桿菌（CCGGD2011)， 并將分離的菌株通過回歸實驗，感染1周齡維雞和6-8周齡小鼠，獲得了同樣的感染致死能 力（菌株保存于吉林大學人獸共患病研究所細菌病實驗室）。CCGGD201101引起了維雞患 病，最終引起大部分維雞死亡，表現出較強的致病性，該與常見的鮑曼不動桿菌不同，表現 出毒力增強的現象。因為鮑曼不動桿菌耐藥性日益嚴重，對于感染鮑曼不動桿菌后的治療， 常規抗生素可能無效，尋找其主要毒力因子，W此為基礎，開發新型的免疫藥物，將會對預 防鮑曼不動桿菌感染發揮重大作用。 免疫保護性抗原通常是細菌重要的毒力相關因子，在細菌的粘附、侵襲等致病過程和 宿主的免疫應答中發揮重要作用。許多鮑曼不動桿菌的表面蛋白已被鑒定為保護性抗原分 子，然而由于該部分蛋白的生物學功能尚不清楚，其是否在A. baumannii的致病過程中發 揮作用還需要進一步的研究。在致病過程中，病原菌的表面蛋白很有可能直接參與和宿主 細胞相互作用。
【發明內容】
本發明提供一種具有免疫保護性的鮑曼不動桿菌表面抗原SurAl，用于制備鮑曼不動 桿菌亞單位疫苗。 本發明采取的技術方案是： 一種具有免疫保護性的鮑曼不動桿菌表面抗原SurAl，其氨基酸序列如SEQ ID No. 1所 述。 編碼所述的一種具有免疫保護性的鮑曼不動桿菌表面抗原SurAl的核巧酸，其序列如 SEQ ID No. 2 所述。 包含所述的核巧酸的重組載體祀T-28a-SurAl。 包含所述的重組載體的大腸桿菌工程菌株。 所述的具有免疫保護性的鮑曼不動桿菌表面抗原SurAl，對于人類肺上皮細胞A549具 有弱毒性，對小鼠具有免疫保護性。 所述的具有免疫保護性的鮑曼不動桿菌表面抗原SurAl在制備鮑曼不動桿菌亞單位 疫苗中的應用。 所述的具有免疫保護性的鮑曼不動桿菌表面抗原SurAl在制備用于預防由鮑曼不動 桿菌引起的疾病的藥物中的應用。 一種包含所述的具有免疫保護性的鮑曼不動桿菌表面抗原SurAl的疫苗組合物。 一種制備具有免疫保護性的鮑曼不動桿菌表面抗原的方法，所述方法包括W下步驟： 構建包含含有SEQ ID No. 2所述的核酸序列的重組表達載體； 將所述重組表達載體轉到宿主菌中； 培養所述經轉化的宿主菌并誘導其表達所述鮑曼不動桿菌免疫保護性抗原； 對所述經過誘導的宿主細胞分離和純化所述鮑曼不動桿菌免疫保護性抗原。 所述的方法中，宿主細胞是大腸桿菌。 本發明通過巧光差異雙向電泳技術對鮑曼不動桿菌（Acinetobacter baumannii,A. baumannii)全組分進行蛋白表達差異分析。目的篩選出抗原性好，保護力強的抗原蛋白，同 時篩選出毒力相關蛋白，W期為發展新型亞單位疫苗的研發及血清學診斷標記奠定堅實的 基礎。 本發明鑒定到具有免疫保護效果的鮑曼不動桿菌表面抗原SurAl蛋白，來源于鮑曼 不動桿菌CCGGD201101，該菌是吉林大學人獸共患病研究所細菌病研究室于2011年在 吉林省農安縣某養雞場病死維雞中分離，經過生理生化鑒定和16s rDNA測序鑒定證明 CCGGD201101為鮑曼不動桿菌，在動物回歸實驗中證明CCGGD201101對維雞、小鼠、大蠟懼 均具有致病性。從CCGGD201101分離到的SurAl蛋白對小鼠感染鮑曼不動桿菌能提供有效 的免疫保護力，可W作為鮑曼不動桿菌亞單位疫苗的候選抗原。 為了實現本發明目的，本發明首先分離鮑曼不動桿菌CCGGD201101的全組分蛋白和參 考菌株ATCC17978的全組分蛋白，然后通過差異巧光雙向電泳技術分離的到表達量差異蛋 白。對表達量差異蛋白進行質譜鑒定，隨后對SurAl蛋白的基因進行克隆、表達、純化。使 用感染鮑曼不動桿菌后康復小鼠的血清檢測SurAl蛋白，發現重組SurAl蛋白可W與康復 血清反應。使用人工重組的SurAl蛋白進行小鼠的免疫保護性實驗，結果表明其具有一定 的免疫保護作用。 本發明具有免疫保護性的鮑曼不動桿菌表面抗原SurAl,該蛋白對與人類肺上皮細胞 A549表現出弱毒性，對小鼠感染鮑曼不動桿菌能提供有效的免疫保護力，可W作為鮑曼不 動桿菌亞單位疫苗開發的候選抗原。
【附圖說明】 圖1(A)是編碼SurAl蛋白的基因擴增圖； 圖1炬）是SurAl基因表達載體雙酶切載體構建圖； 圖2是SurAl蛋白的表達及純化圖； 圖3(A)是不同鮑曼不動桿菌感染小鼠康復血清中抗SurAl抗體滴度圖； 圖3(B)不同鮑曼不動桿菌感染小鼠康復血清中抗SurAlWestern blot圖； 圖4是SurAl亞單位疫苗免疫后抗CCGGD201101感染研究； 圖5是SurAl亞單位疫苗免疫后抗ATCC17978感染研究； 圖6是SurAl免疫后小鼠細胞因子表達水平分析圖； 圖7是SurAl免疫后小鼠血清效價水平及產生抗體類型分析圖； 圖8是SurAl對人類A549細胞殺傷活性圖。
【具體實施方式】 W下的實施例便于更好地理解本發明，但不限定于本發明。下述實施例中得實驗方法， 如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的實驗材料，如無特殊說明，均為常規生 化試劑商店購買。 實施例1、細菌蛋白樣品的制備 蛋白樣品制備 取-80°C冰箱凍存鮑曼不動桿菌標準株ATCC19606和分離株CCGGD201101各ImU分別 接種于200血液體LB培養基中培養，37°C恒溫18化/min培養化。離屯、前稱取50血離屯、 管重量并分別標記，4°C，lOOOOr/min離屯、lOmin棄上清，并用滅菌水反復離屯、清洗兩次棄 上清，收集菌體稱取總重量，并計算收集細菌重量。ATCC19606和CCGGD201101均加入lOmL 0.1mol/L Tris-Cl懸浮沉淀，再加入lOOuL蛋白酶抑制劑與lOOuL核酶混合物充分混勻。 然后進行超聲破碎，功率為200W，5s/次，每次間隔15s，各超聲lOmin，整個過程冰上操作。 4°C，10000Xg 離屯、20min 取上清。
[0040] 二、全組分蛋白樣品的巧光差異雙向電泳值IGE) 蛋白樣品的巧光標記 用BCA法進行蛋白定量，用精確抑試紙調節樣品抑至8. 5。每4(K)pmol染料標記 50ug蛋白。luL染料工作液（400pmol/mL)加入50ug蛋白樣品中混勻，離屯、，避光，冰浴 30min ;再加入luL lOmmol/mL賴氨酸，避光，冰浴15min進行澤滅。切2標記ATCC19606和 CCGGD201101各25 y g蛋白混合物作為內標，切3標記50ug ATCC19606蛋白，切5標記50ug CCGGD201101蛋白，做兩個重復，再將切3標記CCGGD201101蛋白，C巧標記ATCC19606蛋白 共=個重復同時進行凝膠電泳。 雙向電泳實驗 (1) 從-80°C冰箱取出標記蛋白，將標記切2、切3、切5 S個樣品混合，加入水化液至 450祉，并加入1. 4mg DTT和2.加L IPG buffer充分混勻。 (2) 將混合樣品均勻加入到24cm膠條槽中，用綴子夾住IPG干膠條負極端膠面朝下，由 正極端緩慢放入膠條槽中，膠面與水化液間不能產生氣泡，加入l-2mL覆蓋油于膠條上表 面，蓋上蓋子。 SDS-PAGE垂直電泳 (1) 灌膠；配制12. 5%的聚丙締酷胺凝膠250mU放入超聲波清洗器中除泡lOmin，再加 入AI^S和TM邸慢慢混勻。將配好的凝膠溶液對準灌膠模具中間凹槽滑坡面，緩慢倒入防止 氣泡產生，并用正了醇封膠，室溫凝膠化。 (2) 膠條平衡；取出等電聚焦后的IPG膠條垂直于濾紙上吸取覆蓋油，將膠面朝上放 入含1% DTT的平衡液的平衡管中，放在脫色搖床上緩慢震蕩15min ;取出膠條再放入含 2. 5% IAA的平衡液的平衡管中，緩慢震蕩15min。 (3) 裝膠條：將凝膠玻璃板中的正了醇倒掉，用蒸饋水清洗，并用濾紙將水吸干。膠板 平放于實驗臺上，用綴子夾住平衡后的膠條兩端，膠面朝上放在凝膠板上，用潔凈薄尺將負 極端推入，避免觸碰膠面；將膠板直立沿負極端加入0. 5%低烙點瓊脂糖封膠，用薄尺向正 極端推入，邊加邊推，防止膠面與膠條之間有氣泡產生。 (4) 電泳；將膠板放入電泳槽中并用遮光罩蓋住進行垂直電泳。整個電泳過程均在 20°C循環水浴下進行，設置電泳儀參數為600V，400mA，7h。當漠酪藍移動到膠底部時電泳結 束，取下膠板進行掃描分析。 凝膠圖像掃描和分析 應用Ty地oon FLA9500巧光掃描儀在473皿、532皿、635皿的激發波長下分別收集切2、 切3、切5標記的成像。成像需先在1000 ym出進行預掃描，然后使用100 ym精度掃描。其 中光電倍增管PMT的設置范圍為250V-1000V，即S個通道中高豐度蛋白的Max Intensity 值均在6