以苯硼酸酯為連接單元的嵌段聚合物及其合成方法和應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物醫藥技術、納米醫藥及新材料領域，具體涉及以苯硼酸酯為連接 單元的兩嵌段聚合物的合成及其組裝及應用于制備對肝癌細胞具有增強細胞內吞特性的 智能納米膠束載體的用途。
【背景技術】
[0002] 傳統化療藥物在腫瘤的治療上取得很大成功，但有很多局限性限制了其臨床療效 的進一步提高，如嚴重的毒副作用、選擇性差、腫瘤細胞易對其產生耐藥性等。納米藥物載 體為實現化療藥物在腫瘤組織內的定點和快速釋放，減少對正常組織器官的損傷，避免有 效藥物劑量不足導致腫瘤細胞產生耐藥性提供了一個有效途徑。智能納米藥物載體系統主 要是基于腫瘤組織與人體正常組織的微環境差異，如腫瘤組織具有乏氧、酸性pH值、溫度 稍高、有大量生長因子及水解蛋白酶等特點。利用實體瘤的高滲透和長滯留效應（EPR效 應），可使納米載體藥物在腫瘤組織富集，在腫瘤微環境作用下快速解體，迅速釋放出抗腫 瘤藥物"殺死"腫瘤細胞。
[0003] 苯硼酸與順式1，2-或1，3-二羥基化合物（如糖類、兒茶酚等）可形成硼酸酯鍵。 硼酸酯鍵在堿性和中性環境相對穩定，而在酸性環境發生裂解，證實了硼酸酯鍵非常適合 作為酸敏感的納米藥物載體構筑單元。PavelA.Levkin教授用苯硼酸修飾葡聚糖得到兩親 性的聚合物B-Dex。B-Dex自組裝形成的納米粒在pH5. 0的酸性介質中的藥物釋放速度是 在pH7. 4的介質中的藥物釋放速度的5倍，顯示了非常好的酸敏感藥物釋放特性（Biomater ials，2013, 34, 8504-8510)。鐘振林教授課題組發現苯硼酸共價修飾聚乙烯亞胺后對Η印G2 細胞有更高的基因轉染效率，原因之一在于苯硼酸與HepG2細胞膜表面的寡聚糖（Sialyl LewisX)強結合，實現了受體介導的細胞內吞，基因載體系統更容易進入細胞而發生轉染 (ChemicalCommunication, 2010, 46, 5888-5890)，證實了苯硼酸可作為藥物載體系統的革巴 向基團的潛力。
[0004] 傳統的嵌段聚合物構筑的載藥膠束通常以聚乙二醇（PEG)作為親水鏈段，可充分 利用實體瘤的高滲透和長滯留效應（EPR效應），使藥物富集在腫瘤組織，但該類膠束由于 PEG殼層的存在不利于細胞內吞，抗腫瘤藥物難以足劑量到達位于細胞內的作用靶點，此類 膠束的細胞內吞通常是將PEG端用葉酸、半乳糖等靶向基團或抗體修飾來實現受體介導的 細胞內吞。
【發明內容】
[0005] 為了克服現有技術中的上述缺陷，本發明提出了一種以苯硼酸酯為連接單元的兩 嵌段聚合物，以該兩嵌段聚合物構筑的載藥膠束不僅在體內實現長效循環，在腫瘤部位累 積后可脫去PEG殼層，避免PEG阻礙細胞內吞的同時，露出的苯硼酸鍵可以增強其介導的 細胞內吞過程，因此，本發明膠束的構建為實現"長效循環、增強細胞內吞"的新途徑。本發 明制備的兩嵌段聚合物可以用于構筑納米膠束，具有較好的釋藥性，較低的細胞毒性和良 好的細胞吞噬性。
[0006] 本發明提出了一種以苯硼酸酯為連接單元的兩嵌段聚合物，其特征在于，所述兩 嵌段聚合物的結構式如式（I)所示，
[0008] 式（I)中：
[0009] X= 40-120
[0010] m=5-20〇
[0011] 其中，PEG的結構式如式（1)所示：
[0012]
[0013] 其中，BC的結構式如式（2)所示：
[0014]
[0015] 其中，PBLG的結構式如式（3)所示：
[0016]
[0017] 本發明還提出了一種以苯硼酸酯為連接單元的兩嵌段聚合物的合成方法：其特征 在于，所述方法包括以下步驟：（1)合成PEG-NH2的多巴衍生物PEG-3, 4-DA; (2)PEG-3, 4-DA 與3-氨基苯硼酸脫水縮合，得到PEG的苯硼酸酯衍生物PEG-BC; (3)PEG-BC開環5-芐 酯-L-谷氨酸-N-羧基環內酸酐BLG-NCA，即以PEG-BC作為大分子引發劑對5-芐酯-L-谷 氨酸-N-羧基環內酸酐（BLG-NCA)進行開環聚合，得到所述以苯硼酸酯為連接單元的兩嵌 段聚合物PEG-BC-PBLG。
[0018] 本發明還提出了根據上述方法制備的以苯硼酸酯為連接單元的兩嵌段聚合物，所 述兩嵌段聚合物結構如式（I)所示。
[0019] 本發明進一步提出了將所述以苯硼酸酯為連接單元的兩嵌段聚合物用于制備藥 物載體的應用。
[0020] 其中，所述藥物為脂溶性藥物。優選地，所述脂溶性藥物包括阿霉素、吉西他濱、 SN38和紫杉醇。
[0021 ] 其中，所述載體為納米膠束載體，優選地，所述納米膠束載體為酸敏感型。
[0022] 其中，所述納米膠束載體用于增強腫瘤細胞的內吞特性。
[0023] 其中，所述腫瘤細胞為肝癌細胞。
[0024] 其中，所述納米膠束載體的結構為如圖1B所示。
[0025] 本發明利用苯硼酸酯對腫瘤微酸性環境的響應性，以及苯硼酸對細胞膜表面的寡 聚糖具有非常強的結合能力的特點，以苯硼酸兒茶酚酯（BC)為連接單元合成聚乙二醇-聚 谷氨酸兩嵌段聚合物（PEG-BC-PBLG)，進而構建其載阿霉素膠束（PEG-BC0PBLG·Dox)。研 究該PEG-BC0PBLG·?οχ膠束對腫瘤微環境的主動有序響應行為及快速釋藥過程，評價其體 外毒性及抗肝癌活性。該主動有序響應行為及快速釋藥過程具體可描述為：硼酸酯載體膠 束經長效循環充分實現EPR效應后富集于肝癌組織；硼酸酯鍵對胞外微酸性環境響應而斷 裂脫去PEG殼層；裸露出苯硼酸，苯硼酸與細胞膜表面的寡聚糖結合實現苯硼酸介導增強 的主動胞吞，釋放出被包裹的藥物。
[0026] 本發明所涉及的以苯硼酸酯為連接單元的兩嵌段聚合物的結構及載阿霉素納米 膠束PEG-BC0PBLG·Dox示意圖如圖1A所示，實施步驟如下：
[0027] 第一步：苯硼酸酯兩嵌段聚合物的合成與表征
[0028] (1)合成PEG-NH2的多巴衍生物PEG-3, 4-DA; (2)PEG-3, 4-DA與3-氨基苯硼酸 脫水縮合，得到PEG的苯硼酸酯衍生物PEG-BC; (3)PEG-BC開環5-芐酯-L-谷氨酸-N-羧 基環內酸酐（BLG-NCA)，得到以苯硼酸酯為連接單元兩嵌段聚合物PEG-BC-PBLG，表征其結 構；(4)合成用于對照研究的不含苯硼酸酯鍵的兩嵌段聚合物PEG-PBLG，及異硫氰酸熒光 素（FITC)標記的PEG-BC-PBLG-FITC和PEG-PBLG-FITC。
[0029] 第二步：苯硼酸酯兩嵌段聚合物納米膠束系統的構筑及表征
[0030] 用溶劑蒸發法制備PEG-BC0PBLG膠束及載阿霉素膠束PEG-BC0PBLG·Dox，測定其 臨界膠束濃度；用透射電鏡（TEM)觀測其形貌，用動態光散射儀（DLS)測定粒徑大小及分 布；用紫外吸收法測定載藥膠束的包封率和載藥量。
[0031] 所述PEG-BC0PBLG膠束的結構如圖1B所示。
[0032] 兩嵌段聚合物PEG-BC-PBLG自組裝形成PEG-BC0PBLG膠束時，PEG端形成親水外 層，PBLG形成疏水球狀內核（如圖1B所示），PEG和PBLG之間以苯硼酸酯為連接單元。在 酸性條件下苯硼酸酯鍵斷裂時，膠束脫去PEG外層，裸露出苯硼酸端，如圖1C所示；
[0033] 其化學結構如下式（4)所示：
[0034]
[0035] 第三步：嵌段聚合物及納米膠束PEG-BC0PBLG的降解及釋藥性能
[0036] 用1HNMR的方法對嵌段聚合物PEG-BC-PBLG在模擬腫瘤微環境pH值（ρΗ6· 5,pH 6· 0,pH5· 0)及正常血液pH值（ρΗ7· 4)中的降解情況進行動態監測；用DLS追蹤PEG-BCO PBLG納米膠束在上述pH緩沖液中降解后粒徑變化情況；測定載藥膠束PEG-BC0PBLG·Dox 的釋藥性能。
[0037] 第四步：PEG-BC@PBLG納米膠束的細胞吞噬
[0038] 研究細胞表面SialylLewisX較多的Η印G2細胞對PEG-BC0PBLG膠束吞噬行為， 以不含硼酯鍵的PEG0PBLG膠束及細胞表面SialylLewisX較少的HL7702細胞作為對照。 在不同pH值條件下培養3h后，用流式細胞儀測量細胞吞噬FITC標記膠束樣品的熒光值。
[0039] 第五步：載阿霉素PEG-BC0PBLG·Dox膠束的細胞毒性研究
[0040] 噻唑藍（MTT)比色法檢測PEG-BC0PBLG膠束，無硼酸酯連接單元的載阿霉素膠束 PEG0PBLG·Dox，以硼酸酯為連接單元的載阿霉素膠束PEG-BC0PBLG·Dox及Dox在pH7. 4 和pH5. 0培養條件下Η印G2細胞毒性。
[0041] 第六步：載阿霉素膠束PEG-BC0PBLG·Dox抑制裸鼠肝癌模型的生長活性評價
[0042] 評價PEG-BC0PBLG·Dox對裸鼠肝癌模型（HepG2)的生長抑制效果。
[0043] 本發明的有益效果在于：本發明制備的嵌段聚合物可以用于構筑納米膠束，具有 較好的釋藥性，較低的細胞毒性和良好的細胞吞噬性。
【附圖說明】
[0044] 圖1A為以苯硼酸酯為連接單元的兩嵌段聚合物的結構及載阿霉素納米膠束 PEG-BC0PBLG·Dox示意圖；
[0045] 圖1B為PEG-BC0PBLG膠束的結構示意圖；
[0046] 圖1C為PEG-BC0PBLG膠束的結構在酸性條件下苯硼酸酯鍵斷裂時，膠束脫去PEG 外層，裸露出苯硼酸端后的結構示意圖。
[0047] 圖2為以苯硼酸酯為連接單元的嵌段聚合物PEG-BC-PBLG在不同pH介質中降解 的1HNMR譜圖。硼酸酯鍵斷裂后PBLG端不溶于DMS0-D6,而PEG端仍溶于DMS0-D6,圖中 PBLG端特征峰h，i，g處峰面積隨著pH的降低而減小，而PEG端特征峰f，e，d峰面積基本不 變。
[0048] 圖3為PEG-BC-PBLG嵌段聚合物透析純化前后的nBNMR譜圖。A:透析前硼譜，a 為硼酯峰，b為硼酸峰；B:透析后硼譜，只有硼酯峰a。
[0049] 圖4為PEG-BC0PBLG膠束的粒徑分布（DLS圖）及形貌圖（TEM圖）。
[0050] 圖5為PEG-BC0PBLG膠束在不同pH緩沖溶液中的粒徑變化圖。ρΗ7· 4中膠束 粒徑在l〇〇nm左右，相對穩定，隨介質pH降低，膠束的粒徑呈明顯增大的趨勢，分別達到 400, 950, 2100nm。
[0051] 圖6為PEG-BC0PBLG·Dox載藥膠束在不同pH緩沖溶液中的藥物釋放行為。在 pH7. 4介質中，藥物釋放速度較慢，9h累積釋放量僅約10%。隨著介質pH降低釋藥量明顯 增加，在ρΗ5· 0介質中，4hDox釋放高達85%，而對照載藥膠束PEG0PBLG·Dox在ρΗ5· 0 條件下釋藥量僅為 4.8%。A:PEG-BC@PBLG.Dox(pH7.4);BPEG-BC@PBLG.Dox(pH6.5);C PEG-BC0PBLG·Dox(pH6. 0);DPEG-BC0PBLG·Dox(pH5. 0);EPEG0PBLG·Dox(pH5. 0)。
[0052] 圖7為Η印G2或HL7702細胞在不同pH條件下對FITC標記的PEG-BC0PBLG膠束的 細胞吞噬行為熒光強度統計圖。A)PEG0PBLG-FITC作用于Η印G2細胞，B)PEG-BCOPBLG-FITC 作用于ifepG2 細胞，C)PEG-BC@PBLG-FITC作用于HL7702 細胞。
[0053] 圖8為PEG-BC0PBLG膠束載體及載阿霉素（Dox)后在A:pH7. 4;B:pH5. 0培養基 中的細胞毒性。PEGOPBLG·Dox和PEG-BCOPBLG·Dox在pH7. 4條件下都顯示出低毒性，然 而在pH5. 0條件下PEG-BC0PBLG·Dox細胞毒性明顯增高且呈現濃度依賴關系。
[0054] 圖9為PEG-BC0PBLG·Dox對荷瘤裸鼠腫瘤〇fepG2細胞）的生長抑制效果，A)生 理鹽水，B)Dox·HC1，C)PEG-BC@PBLG載體，D)PEG-BC@PBLG·Dox〇
[0055] 圖10為荷瘤裸鼠