一種具有大雙光子熒光活性截面的膜通透性染料及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明設及一種雙光子染料及其應用，尤其設及一種具有大雙光子巧光活性截面 的膜通透性染料及其應用。
【背景技術】
[0002] 雙光子顯微鏡的發展已經徹底改變了對器官和組織、特別是厚的或高散射的標本 的觀測。與單光子激光共聚焦顯微鏡相比，雙光子顯微鏡具有諸如近紅外光激發、避免巧光 漂白和光致毒、高分辨率、減小組織吸光及降低組織自發巧光干擾等特點。但是，如果所用 巧光探針的雙光子吸收截面小（與生物樣品的內源性發光物質相近），那么雙光子顯微鏡 優勢會被大打折扣。因為染料的單、雙光子吸收服從不同的選律，所W優良的單光子染料不 一定具有大的雙光子吸收截面。目前用于激光共聚焦顯微鏡的單光子染料幾乎都不具備大 的雙光子巧光活性吸收截面。因而，針對該技術的雙子染料和探針的研究成為一個熱口課 題。
[0003] 最近，許多課題組報道了大量的雙光子染料和探針。雖然近期報道的雙光子染料 具有大的雙光子巧光活性吸收截面，但是常用的雙光子染料依舊是羅丹明（吸收截面只有 200GM左右）。運是因為羅丹明具有良好的膜通透性。細胞膜通透性是一個優良生物巧光 染料的重要參數。目前，生物巧光成像中所使用的染料很少同時具備大的雙光子巧光活性 吸收截面和良好的細胞膜通透性。運在很大程度上制約了利用雙光子=維成像技術進行細 胞生物成像與觀測。因而開發、研制具有實際應用價值的雙光子膜通透性巧光染料是當務 之急。
【發明內容】
[0004] 針對現有技術的不足，本發明要解決的問題是提供一種具有大雙光子巧光活性截 面的膜通透性染料及其應用。
[0005] 本發明所述具有大雙光子巧光活性截面的膜通透性染料，其特征在于：所述染料 是=苯胺雜環類化合物，其化學結構通式如式（I)所示：
[0006]
(I)
[0007] 其中：上述式中R表示NH或S原子。
[0008] 上述具有大雙光子巧光活性截面的膜通透性染料通式（I)中所述R優選表示S原 子。
[0009] 上述具有大雙光子巧光活性截面的膜通透性染料具體優選是4-[巧苯 并嚷挫-2-基）乙締基]-N-{4-[巧)-2-(1H-苯并嚷挫-2-基）乙締基]苯基}-N-苯基苯 胺。
[0010] 本發明所述具有大雙光子巧光活性截面的膜通透性染料苯胺雜環類化合物） 的制備方法概述如下：
[0011] 發明人首先通過Wilsmeier反應在立苯胺上引入兩個醒基，然后利用Wittig反 應再引入兩個雙鍵，最后利用與鄰琉基苯胺、鄰二苯胺、或鄰徑基苯胺的扣環反應得到終產 物一一=苯胺雜環類化合物。
[0012] 上述=苯胺雜環類化合物具體制備反應式如下：
[0013]
4-膽)-2-(lH-苯并唾峨-2-基)己婦基]-N-H-膽)-2-(舊- 苯并唾嗤-2-基)藝帰萄苯基}-N-苯基苯胺 威：
4-脾苯并咪睡-2-基)乙婦基]-N-H-KE) -2-( 1H-苯并咪哩-2-基)己締基]苯基} -N-苯基苯胺
[0014] 本發明所述具有大雙光子巧光活性截面的膜通透性染料在顯示活細胞中細胞質 雙光子成像中的應用。
[0015] 其中，所述活細胞優選為化La細胞或RBk2H3細胞；在細胞質中無祀向性。
[0016] 試驗結果證實，本發明所述具有大雙光子巧光活性截面的膜通透性染料（=苯胺 雜環類化合物）能夠很容易的通過細胞膜，在細胞質區域呈現出明顯的巧光顯微圖像，運 為應用雙光子顯微鏡成像活細胞中細胞質的研究提供了有益的幫助，同時也為開發簡捷、 直觀的巧光檢測試劑提供了技術支持。
[0017] 本發明的有益效果是：利用實驗篩選，本發明確立了一類新型具有大雙光子巧光 活性截面的膜通透性染料，即=苯胺雜環類化合物。本發明所述=苯胺雜環類化合物具有 價格低、激發能量低、顯色強、生物相溶性較好的特點。進一步的試驗證實，本發明的立苯胺 雜環類化合物具有比較大的雙光子巧光活性吸收截面、優秀的細胞膜通透性和低毒性等特 點。并且本發明所述的染料和已有的探針DAPI具有良好生物相容性，在激光激發巧光生物 標記領域具有潛在的應用價值。也預示本發明所述=苯胺雜環類化合物作為雙光子巧光染 料具有廣闊應用前景。
【附圖說明】
[001引 圖1 :4-[巧苯并嚷挫-2-基）乙締基]-N-{4-[巧苯并嚷 挫-2-基）乙締基]苯基} -N-苯基苯胺對活性化Ia和1?心甜3細胞進行染色在單光子共 聚焦巧光顯微鏡下得到的巧光顯微照片。
[0019] 其中a圖為用4-[似苯并嚷挫-2-基）乙締基]-N-{4-[巧苯 并嚷挫-2-基）乙締基]苯基}-N-苯基苯胺染色得到的巧光顯微照片；b圖為明場照片；C 圖為左中兩圖的合并圖即共定位圖。
[0020] 圖2 :4-[巧苯并嚷挫-2-基）乙締基]-N-{4-[巧苯并嚷 挫-2-基）乙締基]苯基} -N-苯基苯胺對活性化Ia和1?心甜3細胞進行染色后在800納 米激光福照下得到的雙光子巧光顯微照片。
[0021] 其中a圖為用4-[似苯并嚷挫-2-基）乙締基]-N-{4-[巧苯 并嚷挫-2-基）乙締基]苯基}-N-苯基苯胺染色得到的雙光子巧光顯微照片；b圖為明場 激光掃描的微分顯微照片；C圖為左中兩圖的合并圖。
[0022] 圖3 :4-[巧苯并嚷挫-2-基）乙締基]-N-{4-[巧苯并嚷 挫-2-基）乙締基]苯基} -N-苯基苯胺和艦化丙晚對活化Ia細胞進行染色后，分別在405 和561納米激光福照下分為兩個通道收集得到的單光子共聚焦巧光顯微照片。
[0023] 其中a為405納米激發綠色通道的照片，b為561納米激發紅色通道的照片，C為 明場照片，d圖為曰、b、CS者合并圖片。
[0024] 圖4:4-[巧苯并嚷挫-2-基）乙締基]-N-{4-[巧苯并嚷 挫-2-基）乙締基]苯基}-N-苯基苯胺、DAPI分別依次對活性化Ia細胞進行染色后在， 分別在405和561納米激光福照下分為兩個通道收集得到的單光子共聚焦巧光顯微照片。 [00巧]其中a為綠色通道的照片，b為藍色通道的照片，C圖為前兩者合并圖片。
【具體實施方式】
[0026] 實施例1:
[0027] 4, 4-2甲酯基S苯胺的合成
[0028] 將20ml的DMF加入到單口燒瓶中。在冰水浴攬拌下，向上述溶液中緩慢滴加=氯 氧憐20ml，室溫攬拌比，得到黃色渾濁液。稱取=苯胺5g(20. 4mmol)，用IOml=氯甲燒將其 溶解，然后再逐漸加入上述攬拌的溶液中，加熱回流反應10小時。將反應液傾入到1000 mL 水中，用CH2CI2萃取。有機層用飽和氯化鋼溶液洗涂，無水MgSO4干燥，過濾，蒸除溶劑。粗 產品用柱色譜分離，石油酸/乙酸乙醋（10 : 1)作淋洗液，得到淺黃色固體，即為4, 4-2甲 酷基=苯胺。產率：55%。
[0029]IhNMR(400MHz,d6-DMS0) : 5 (ppm) 9. 88(S,2H)，7. 85 (d,J= 8. 64Hz, 4H) , 7. 49 (t,J= 7. 84Hz, 2H) , 7. 33 (t,J= 7. 4Hz,IH), 7. 22 (d,J= 8. 4Hz, 2H)，7. 17 (d,J= 8. 56Hz, 4H).
[0030] (2E，沈)-3, 3 (苯基苯胺）2 (1，4-亞苯基）丙締醒的合成
[00引]將化41邑，8臟〇^4,4-2甲酯基^苯胺和化24邑，19.2臟〇^(1，3-二氧戊環-2甲 基）-S苯基漠化麟加入到S口燒瓶，加入100mLS氯甲燒將其溶解。在室溫和氮氣保護下 攬拌30分鐘。然后再加入（12.68g，112mmol)叔下醇鐘。再繼續反應24小時。將反應液 傾入到1000 mL水中并在其中攬拌6小時，用CH2CI2萃取。有機層用飽和氯化鋼溶液洗涂， 無水MgS〇4干燥，過濾，蒸除溶劑。粗產品用柱色譜分離，石油酸/乙酸乙醋（4 : 1)作淋 洗液，得到黃色固體，即為（2E，沈)-3,3(苯基苯胺）2(1,4-亞苯基）丙締醒。產率：57%。 [003引IhNMR(400MHz, (16-DMS0) : 5 (ppm) 9. 64 (d,J= 7. 8Hz, 2H)，7. 7 (t,J =9.08Hz, 6H), 7.44 (t,J= 7.78Hz, 2H), 7.26 (t,J= 7.36Hz,IH), 7.17 (d,J= 7. 75Hz, 2H)，7. 06 (d,J= 8. 56Hz, 4H)，6. 77 (dd,Ji=J2= 7. 8Hz, 2H).
[0033] 4-[巧)-2- (IH-苯并嚷挫-2-基）乙締基]-N- {4-[巧)-2- (IH-苯并嚷挫-2-基）