本發明屬于生物材料技術領域，具體涉及一種利用水包油型固體乳化制備不同粒徑多孔β-TCP微球的方法。
背景技術：
治療因先天性疾病、意外、組織病變等造成的骨組織損傷是骨科的一個重大難題。骨組織損傷造成的自體不能愈合或愈合困難，衍生了很多的治療方法以達到病人正常的生命活動。傳統的治療方法包括軟骨鉆孔術、自體或異體軟骨移植術等。但這些方法都有各自的缺陷，難以在臨床廣泛應用。骨組織工程支架應運而生，其克服或改進了以上的困難，為解決骨組織損傷的患者帶來了福祉。
磷酸鈣是人體硬組織中的一種重要無機成分，廣泛存在于牙齒和骨部位。磷酸鈣陶瓷由于其突出的生物相容性、生物活性和骨誘導性，經常被用作骨移植替代材料。β-TCP作為一種磷酸鈣陶瓷，與天然骨基質有相似的組成，并且生物相容性良好以及可降解，在體內可以以體液介導和細胞介導的方式降解，其降解產物能參與生命活動和代謝，成為有生命組織的一部分。
β-TCP陶瓷在骨組織工程中，可由粉末、微球、大塊支架等形式進行應用。粉末形式的應用通常缺乏氣孔，不能為細胞提供良好的生長場所以及營養運輸。傳統的β-TCP大塊支架由于其脆性，而不能切割成特殊的形狀以應用于不規則的骨缺損。而微球形式正好能克服以上的缺陷，此外微球還具有大的比表面積，可塑性并且可用于載藥，能給細胞提供良好的場所和營養運輸。因此制備β-TCP微球并將其應用于骨組織損傷治療成為了當今時代的熱點。
微球的研究開始多以實心微球為主，例如PEREZ R A等人[Tissue.Eng.Regen.Med.,2013,7:353.]通過將α-TCP骨水泥加入到植物油中，用乳化法制備得到實心微球，所得的微球比表面積小，氣孔率低。Bernhardt等人[Sci-Mater.Med.,2013,24,1755]以含有HA粉末的海藻酸鹽溶膠通過離子型凝膠作用成球,再在650℃下燒除海藻酸鹽得到表面有大孔結構的HA微球。
盡管近年來制備不同粒徑而保持多孔結構的微球方法不時有所報道，但有些方法存在過于復雜、成本高、會引入抗原性物質以及成功率低等問題。
技術實現要素：
本發明的目的在于克服當前β-TCP微球制備過程中存在的上述不足和問題，利用水包油型固體乳化制備得到了不同粒徑的多孔β-TCP微球，該方法操作簡單、成功率高且不會引入新的雜質。為實現上述目的，本發明所采用的技術方案如下：
利用水包油型固體乳化制備不同粒徑多孔β-TCP微球的方法，包括以下步驟：(a)將硝酸鈣溶液和磷酸氫銨溶液混合反應，調節溶液pH至中性，分離得羥基磷灰石前驅體；(b)將聚乙烯醇縮丁醛(PVB)溶于有機溶劑中得聚乙烯醇縮丁醛溶液，將羥基磷灰石前驅體分散到聚乙烯醇縮丁醛溶液中得混合溶液，將混合溶液滴加到攪拌狀態下的聚乙烯醇(PVA)溶液中，分離得前驅體微球；(c)前驅體微球燒結即得多孔β-TCP微球。
進一步的，步驟(a)具體為將磷酸氫銨溶液緩慢滴加到硝酸鈣溶液中，反應物硝酸鈣與磷酸氫銨的摩爾比為3:2。
進一步的，所述硝酸鈣溶液的濃度為0.5mol/L-2mol/L，所述磷酸氫銨溶液的濃度為0.3mol/L-1.2mol/L。
進一步的，步驟(a)中用氨水將溶液pH調至中性后陳化24-48h，接著過濾并用去離子水洗滌得沉淀，將沉淀置于-40℃至56℃干燥24-48h得羥基磷灰石前驅體。
進一步的，步驟(b)中羥基磷灰石前驅體與聚乙烯醇縮丁醛的質量比為6：3-2。
進一步的，步驟(b)中聚乙烯醇溶液與混合溶液的體積比為100:2-4。
進一步的，步驟(b)中將聚乙烯醇縮丁醛溶于二氯甲烷中得到濃度為25-50g/L的聚乙烯醇縮丁醛溶液，所述聚乙烯醇溶液的質量分數為1％。
進一步的，步驟(b)中在4-8℃、200-500rpm的攪拌速度下，將混合溶液滴加到聚乙烯醇溶液中，滴加完成后過濾并用去離子水洗滌固體顆粒，將固體顆粒置于-40℃至56℃干燥24-48h得前驅體微球。
進一步的，步驟(c)中燒結過程具體為：首先將前驅體微球以2℃/min的升溫速率從室溫升至600℃，保溫2h；接著以5℃/min的升溫速率升至1100℃，保溫2小時；最后冷卻至室溫。
與現有技術相比，本發明具有以下有益效果：(1)制得的β-TCP微球具有不同的粒徑和多孔結構、較大的比表面積和良好的生物相容性；(2)通過控制油相濃度以及轉速達到控制微球粒徑的目的，因此根據不同要求可制備不同粒徑的微球，操作簡便、產量高；(3)制備得到的β-TCP微球應用廣泛，可用于載藥和注射以及生物支架材料和不規則骨組織損傷修復材料等方面。
附圖說明
圖1是本發明實施例1制備的β-TCP多孔微球的X射線衍射圖。
圖2是本發明實施例1制備的β-TCP多孔微球的場發射掃描電子顯微鏡照片。
圖3是本發明實施例2制備的β-TCP多孔微球的場發射掃描電子顯微鏡照片。
圖4是本發明實施例3制備的β-TCP多孔微球的場發射掃描電子顯微鏡照片。
圖5是本發明實施例4制備的β-TCP多孔微球的場發射掃描電子顯微鏡照片。
圖6是本發明實施例4制備的β-TCP多孔微球中某單個微球的場發射掃描電子顯微鏡照片。圖7是本發明實施例4制備的β-TCP多孔微球中某單個微球的表面場發射掃描電子顯微鏡(SEM)照片。
具體實施方式
為使本領域普通技術人員充分理解本發明的技術方案和有益效果，以下結合具體實施例進行進一步說明。
實施例1
稱取3.9618g(NH4)2HPO4、11.8075gCa(NO3)2·4H2O分別溶于去離子水中，用100mL容量瓶定容。將100mL(NH4)2HPO4溶液由分液漏斗緩慢滴加到90mLCa(NO3)2溶液中，用氨水調節溶液的pH＝7。溶液陳化24小時后過濾，將所得沉淀用去離子水洗滌5次，將沉淀放入-21℃冰箱中進行冷凍干燥，得到納米級別的羥基磷灰石前驅體。稱取0.5g PVB溶于10mL二氯甲烷溶劑中，攪拌12小時，再稱取1g羥基磷灰石前驅體加入到溶液中，繼續攪拌3小時，得到漿料。將5gPVA溶于500mL去離子水中得PVA溶液，在8℃、轉速為200rpm條件下，將漿料滴加到PVA溶液中，攪拌3小時后過濾，用去離子水洗滌5次，所得固體采用和前述同樣方式冷凍干燥后得到前驅體微球。將前驅體微球置于馬弗爐中燒結得到多孔β-TCP微球，燒結程序為：從室溫升溫至600℃的升溫速率為2℃/min，600℃保溫2小時，再從600℃以5℃/min的速率升溫至1100℃，1100℃保溫2小時，最后冷卻至室溫。
圖1是本發明實施例1制備得到的多孔β-TCP微球的X射線衍射(XRD)圖。該XRD圖正好對應PDF卡片09-0169，說明此微球的化學成分為β-TCP。圖2為本發明實施例1所制得的多孔β-TCP微球的SEM圖，該圖顯示其粒徑在400-500um。
實施例2
稱取0.5g PVB溶于15mL二氯甲烷中溶劑中，攪拌12小時，再稱取1g實施例1制得的羥基磷灰石前驅體加入到溶液中，攪拌3小時，得到漿料。將5gPVA溶于500mL的去離子水中得PVA溶液，在8℃、轉速為200rpm條件下，將漿料滴加到PVA溶液中，攪拌3小時后過濾，用去離子水洗滌5次，所得固體冷凍干燥后得到前驅體微球。將前驅體微球置于馬弗爐中燒結得到多孔β-TCP微球，燒結程序為：從室溫升溫至600℃控制升溫速率為2℃/min，600℃保溫2小時，再以5℃/min的升溫速率從600℃升溫至1100℃，保溫2小時，最后冷卻至室溫。
圖3是本發明實施例2制得的多孔β-TCP微球的SEM圖，該圖顯示其粒徑在150-200um。
實施例3
稱取0.5g PVB溶于10mL二氯甲烷溶劑中，攪拌12小時，再稱取1g實施例1制得的羥基磷灰石前驅體加入到溶液中，攪拌3小時，得到漿料。將5gPVA溶于500mL的去離子水中得PVA溶液，在8℃、轉速為400rpm條件下，將漿料滴加到PVA溶液中，攪拌3小時后過濾，用去離子水洗滌5次，所得固體冷凍干燥后得到前驅體微球。將前驅體微球置于馬弗爐中燒結得到多孔β-TCP微球，燒結程序為：從室溫升溫至600℃控制升溫速率為2℃/min，600℃保溫2小時，再以5℃/min的升溫速率從600℃升溫至1100℃，保溫2小時，最后冷卻至室溫。
圖4是本發明實施例3制得的多孔β-TCP微球的SEM圖，該圖顯示其粒徑在200-250um。
實施例4
稱取0.5g PVB溶于15mL二氯甲烷溶劑中，攪拌12小時，再稱取1g實施例1制得的羥基磷灰石前驅體加入到溶液中，攪拌3小時，得到漿料。將5gPVA溶于500mL的去離子水中得PVA溶液，在8℃、轉速為400rpm條件下，將漿料滴加到PVA溶液中，攪拌3小時后過濾，用去離子水洗滌5次，所得固體冷凍干燥后得到前驅體微球。得到多孔β-TCP微球，燒結程序為：從室溫升溫至600℃控制升溫速率為2℃/min，600℃保溫2小時，再以5℃/min的升溫速率從600℃升溫至1100℃，保溫2小時，最后冷卻至室溫。
圖5是本發明實施例4制得的多孔β-TCP微球的SEM圖，該圖顯示其粒徑在50-100um。圖6和圖7分別為實施例4所制得的β-TCP微球在放大倍數為500和5000下的SEM圖，可惜清晰的觀察到微球表面的多孔結構。
上面結合附圖對本發明的實施例進行了描述，但是本發明并不局限于上述的具體實施方式，上述的具體實施方式僅僅是示意性的，而不是限制性的，本領域的普通技術人員在本發明的啟示下，在不脫離本發明宗旨和權利要求所保護的范圍情況下，還可做出很多形式的改變，這些均屬于本發明的保護之內。