一種基于熒光猝滅的蛋白激酶活性分析方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物分子檢測技術領域，具體涉及一種以納米二氧化鐘(Nano Ceria)為磷酸化多肽特異性識別以及熒光猝滅元件，操作簡單、成本低廉的即混即測型蛋白激酶活性檢測方法。
【背景技術】
[0002]細胞信號轉導，是指細胞外信號分子通過與細胞表面或胞內受體的結合，引發胞內級聯反應，進而調節胞內特定蛋白酶的活性或誘導特定基因的表達，使細胞發生應答反應的過程。在此過程中，蛋白質磷酸化發揮著至關重要的作用，細胞內大部分的生命過程，如代謝、物質運轉、生長、發育、凋亡、神經活動等都與蛋白質磷酸化密切相關。
[0003]蛋白激酶是調控蛋白質磷酸化的最重要的生物分子。蛋白激酶是能夠將Y-磷酸基團從腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)上轉移至底物蛋白特定氨基酸殘基上的一大類酶，目前已發現的蛋白激酶超過500種，人體約30%的蛋白質受到激酶的調控。其一方面通過磷酸化作用調節下游蛋白質的活性，另一方面通過蛋白質的逐級磷酸化，使信號逐級放大引起細胞反應。因此，蛋白激酶的活性失調會引起細胞內多種信號通路出現傳導異常，導致老年癡呆、腫瘤等多種疾病。例如，蛋白激酶B (PKB)在許多惡性腫瘤中都有著過高的活性，腫瘤細胞的增殖往往都伴隨著多種酪氨酸激酶(PTK)活性的異常活躍；而蛋白激酶A(PKA)的活性失調與老年癡呆癥的發生密切相關。
[0004]由于許多重大疾病的發生都與蛋白激酶活性異常活躍密切有關，因此對蛋白激酶活性進行準確監測是深入揭示疾病發生機制，對相關疾病進行早期診斷的重要途徑。此外，設計和開發以蛋白激酶為靶點的新藥，通過抑制過高的蛋白激酶活性進而有效調節、控制信號轉導通路治療疾病，無疑是一種高效的途徑。這也使得蛋白激酶成為治療癌癥、糖尿病、老年癡呆等復雜疾病的重要藥物靶點，據報道，當前很大一部分新藥的研發都是以蛋白激酶作為作用靶點的。因此，開發建立操作簡單、成本低廉、快速靈敏的蛋白激酶活性分析方法，是相關領域研宄的關鍵基礎和前提。
[0005]傳統的蛋白激酶活性檢測方法可大致歸結為如下幾類:(I)放射性標記技術，曾是蛋白激酶活性分析的標準方法。但存在放射性污染問題，對人體及環境都存在一定危害，因此雖尚有一些應用，但正逐漸被其它技術所取代。(2)基于抗體的識別技術。利用對特定磷酸化氨基酸位點具有特異性識別能力的親和抗體，結合熒光、光散射、電化學及比色等各種檢測技術，是當前蛋白激酶活性分析領域最為活躍的研宄方向。雖然該類方法目前已經取得了很好的進展，但仍面臨著如下挑戰:首先，磷酸化識別抗體制備復雜，檢測不同的激酶需要不同的抗體，成本高，且其活性會受到儲存環境、反應介質及個人操作等多種因素的影響，對檢測結果的穩定性造成較大影響。其次，基于抗體識別的蛋白激酶活性檢測方法往往需要在抗體上面預先連接熒光或電化學活性的標記物，這就大大增加了操作的復雜性，限制了其應用范圍。另外，多數磷酸化識別抗體都是活性蛋白，以此類激酶活性檢測方法進行酶抑制劑藥物篩選和開發時，有時很難區分抑制作用是來源于待篩選的分子對激酶還是對抗體活性的抑制，不適于大規模的抑制劑藥物篩選。
[0006]因此，考慮到蛋白激酶抑制劑篩選工作量大以及檢測成本等各方面的需要，理想的蛋白激酶活性檢測方法應擺脫對識別抗體和放射性標記的依賴性，且需滿足操作簡便、成本低廉、靈敏度高等特點。
【發明內容】
[0007]本發明所要解決的技術問題在于提供一種操作簡便、成本低、快速靈敏、無需復雜儀器的即混即測型(mix-and-read)蛋白激酶活性分析方法。
[0008]解決上述技術問題所采用的技術方案由下述步驟組成:
[0009]由下述步驟組成:
[0010]1、將已知活性的蛋白激酶與其對應的熒光標記多肽底物混合進行磷酸化反應。
[0011]2、將納米二氧化鈰水溶液與步驟I中磷酸化反應后的溶液混合，檢測混合體系的熒光強度，根據不同活性蛋白激酶對應的熒光強度繪制標準曲線。
[0012]3、按照上述步驟I和2測試待測蛋白激酶對應的熒光強度，根據標準曲線即可實現待測蛋白激酶活性的定量分析。
[0013]上述步驟I中，所述的熒光標記多肽底物中的熒光標記物為熒光素類、羅丹明類、香豆素類及其衍生物中的任意一種或花青染料或半導體量子點，具體如:羧基四甲基羅丹明、2，7- 二甲基-4，5- 二氯-6-羧基熒光素、四氯-6-羧基熒光素、六氯-6-甲基熒光素、德克薩斯紅、3H-吲哚菁染料等；所述的蛋白激酶是能夠將絲氨酸、蘇氨酸或酪氨酸蛋白磷酸化的激酶，具體如:蛋白激酶A、蛋白激酶C、SRC激酶等。
[0014]上述步驟2中，優選按照每微摩爾熒光標記多肽底物加入10?80mg納米二氧化鐘，且控制混合體系中納米二氧化鐘的濃度為15?120 μ g/mL ;進一步優選按照每微摩爾熒光標記多肽底物加入20?60mg納米二氧化鈰，且控制混合體系中納米二氧化鈰的濃度為40?80 μ g/mL ;其中所述的納米二氧化鐘的粒徑為5?lOOnm。
[0015]本發明的有益效果如下:
[0016]1、本發明首次提出利用納米二氧化鈰可通過其表面鈰離子與磷酸基團的強結合能力選擇性捕獲蛋白激酶催化生成的磷酸化多肽底物，以及二氧化鈰對吸附在其表面的熒光染料的強猝滅能力，構建非放射性、非抗體依賴性蛋白激酶活性分析方法，該方法除了必需的蛋白激酶反應體系外，只需要二氧化鈰這一種額外的檢測試劑，克服了傳統放射性標記及抗體識別方法中存在的放射性危害、步驟繁瑣、成本高昂、需要專業人員操作等不足，具有快速可靠、經濟靈敏等諸多的優勢，在普通的化學及生物相關實驗室均可進行。
[0017]2、本發明所建立的蛋白激酶活性分析方法操作極為簡便，只需將蛋白激酶反應體系直接與納米二氧化鈰溶液混合后即可馬上進行熒光信號的讀出，真正實現了即混即測型的蛋白激酶活性分析。
[0018]3、熒光分析方法非常適合于與一些自動化儀器相結合進行高通亮檢測，因此本發明提出的這種操作簡單、成本低廉的分析方法在高通量蛋白激酶抑制劑的篩選研宄中也展現出了獨特的優勢。
【附圖說明】
[0019]圖1是熒光強度隨PKA活性變化的熒光光譜圖。
[0020]圖2是(Ftl-F)/Ftl值隨PKA活性變化的線性曲線圖。
[0021]圖3是蛋白激酶C(PKC)對應的熒光標記未磷酸化多肽底物在加入納米二氧化鈰前(曲線a)、后(曲線b)的熒光光譜圖。
[0022]圖4是蛋白激酶PKC對應的熒光標記磷酸化多肽底物在加入納米二氧化鈰前(曲線a)、后(曲線b)的熒光光譜圖。
[0023]圖5是熒光強度隨抑制劑H-89濃度變化的熒光光譜圖。
[0024]圖6是熒光強度隨抑制劑H-89的濃度對數值變化的曲線圖。
【具體實施方式】
[0025]下面結合附圖和實施例對本發明進一步詳細說明，但本發明的保護范圍不僅限于這些實施例。
[0026]實施例1
[0027]以PKA為例，其活性分析方法如下:
[0028]1、將6 yL50 μπιο?噸4羧基四甲基羅丹明標記的多肽(由吉爾生化上海有限公司提供，多肽的氨基酸序列為LRRASLG)水溶液、4.8 μ L500 ymol.T1ATP水溶液加入離心管中，然后加入不同體積的0.1U.μ L-1或IU.μ L ^的PKA水溶液并用5OmmoI.L ^1Tris-HCl緩沖溶液(pH值7.5，25°C，含1mmol.T1MgCl2)定容至100 μ L，使所得混合體系中PKA活性分別為 0,0.0001,0.0005,0.001,0.002,0.005,0.01,0.02,0.03,0.05,0.1,0.5U.μ ?Λ在恒溫培養振蕩器上37°C溫育60分鐘，進行磷酸化反應。
[0029]2、向步驟I中磷酸化反應后的溶液中加入100 UL 120 μ g/mL納米二氧化鈰(粒徑為20nm